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研究背景和目的非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic Fatty Liver Disease,NAFLD)是指以肝细胞中脂肪过多积累为主要特征,并除外酒精和其他已知的可致使肝损害因素的临床病理综合征。疾病谱包含单纯性非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(Non-alcoholic Steatohepatitis,NASH)和非酒精性脂肪性肝硬化。近年来,NAFLD已成为了当今社会上最常见的慢性肝病之一,全球有大约四分之一人口受到该病的影响。根据流行病学统计,全球范围内NAFLD的患病率大约为25.24%,NASH患病率估计在3%至5%之间。西方国家中NAFLD是导致慢性肝病的首要因素,随着我国经济社会的快速发展以及饮食结构和生活方式的改变,目前NAFLD已成为我国第二大常见的肝脏疾病。临床上绝大部分NAFLD患者无明显症状或体征,不予任何干预措施情况下其中20%-25%单纯性非酒精性脂肪肝会进展为NASH,与单纯的脂肪肝相比NASH进展为肝硬化的风险更高,大约20%NASH患者可进一步发展为肝硬化和肝癌。除了对肝脏本身造成不良影响,NAFLD还被证实与多种肝脏外疾病相关,如心脑血管疾病、恶性肿瘤、慢性肾脏病、甲状腺疾病等。由此可看出NAFLD尤其是NASH严重危害了人群健康,大大增加了医疗经济负担,成为迫切需要解决的公共健康问题。然而NAFLD发病机制尚未完全明确,且缺少有效的治疗。截至目前,“多次打击学说”成为NAFLD发生及发展的主流学说。而在NAFLD发病机制领域中炎症反应和脂质代谢紊乱被认为是NAFLD发生及发展的重要组成部分。炎症小体作为固有免疫的重要组分能被多种类型的病原体或危险信号所激活,在多种疾病过程中都发挥了关键作用,而NLRP3炎症小体作为炎症小体家族比较常见的一种,对它的研究最多,同时它的结构和功能也是最为明确的,有研究认为它参与了肝脏的无菌性炎症反应。脂联素(Adiponectin,APN)是内源性生物活性多肽或蛋白质,它主要由脂肪细胞分泌,作为调节因子调控机体脂质代谢,从而发挥重要的作用。因此本研究拟通过构建小鼠NAFLD模型和临床样本研究两方面来探究NLRP3炎症小体和脂联素在NAFLD中的作用,旨在为该病的发病机制研究提供实验依据。研究方法1.动物实验研究:将24只6-8周C57雄性小鼠适应性喂养1周后,随机分成2组,每组12只:对照组和高脂组,分别予普通饲料、高脂饲料喂养,每周称重小鼠并观察小鼠生长情况(毛发、活动、精神状态),8周后处死小鼠,比较两组小鼠体重、肝脏湿重、肝指数,留取血清及肝脏组织标本,检测血清相关指标(转氨酶、血糖、血脂),通过HE染色、油红0染色观察小鼠肝脏病理学改变。通过蛋白免疫印迹(Westem-Blot)检测肝脏NLRP3炎症小体、脂联素相关蛋白(NLRP3、IL-1β;APN、PPAR-α)表达水平。2.临床样本研究:根据纳入标准和排除标准收集2018年10月至2018年12月在南方医院消化内科病房住院并经腹部超声诊断的NAFLD患者和非NAFLD患者(各30例)血清标本,运用酶联免疫吸附实验(ELISA)方法检测两组患者血清IL-1β、IL-18、脂联素水平,并收集患者血常规、肝肾功能、血脂、血糖等临床资料,比较两组患者IL-1β、IL-18、脂联素水平。3.统计学方法:采用SPSS22.0进行统计分析,计量资料以均数±标准误表示,计数资料以百分率表示,符合近似正态分布的两组间数据比较采用独立样本t检验分析,非正态分布资料组间比较采用Wilcoxon秩和检验分析,百分率比较采用卡方检验分析,采用协方差分析去除混杂因素影响,P<0.05时认为差异有统计学意义。研究结果1.C57小鼠喂养2周后,高脂组小鼠出现精神萎靡,活动减少,眼神呆滞,毛发无光泽、紊乱且脱落明显;造模8周后高脂组小鼠较对照组小鼠体重(33.09±0.51;30.18±0.23)、肝脏湿重(1.32±0.01;1.16±0.02)明显增加(戶<0.05);肝脏指数(0.43±0.004;0.42±0.004)平均数值较高,但两者差异无统计学意义(P>0.05)。2.高脂组小鼠和对照组小鼠血清检测结果显示,血清ALT(32.19±0.65;24.01±1.05)、AST(55.22±1.04;43.00±1.06)、GLU(10.08±0.41;5.91±0.24)、CHOL(8.25±0.15;5.52±0.18)、TG(2.27±0.23;2.13±0.20)均有差异,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.与对照组小鼠相比,高脂组小鼠肝脏体积大、颜色变深、质地韧,HE染色可见肝细胞明显空泡样脂肪变、少许炎细胞浸润;油红O染色显示肝脏脂滴沉积明显,提示小鼠NAFLD模型造模成功。4.Westem-Blot结果显示,与对照组小鼠相比,高脂组小鼠肝脏NLRP3炎症小体及下游的IL-1β表达水平上调,APN及下游PPAR-α表达水平下调(如图3-2、图3-3)。5.临床样本研究结果显示,与非NAFLD患者相比,NAFLD组患者BMI(24.7±0.55;22.5±0.62)、ALT(25.3±3.04;16.4±1.96)、GLU(5.44±0.29;4.56±0.10)水平升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。NAFLD组患者血清NLRP3炎症小体下游分子IL-1β(8.69±1.39;7.98±0.40)、IL-18(59.88±1.30;56.19±1.07)水平升高,而APN(12.79±0.93;15.61±0.89)水平降低,差异均具有统计学意义(P<0.05);运用协方差分析方法去除BMI、GLU、ALT三项因素影响后,两组患者血清IL-1β、IL-18、APN差异仍有统计学意义(P<0.05)。研究结论本研究通过高脂饲料持续喂养8周成功构建C57小鼠非酒精性脂肪性肝病模型;NLRP3炎症小体表达上调、脂联素表达下调可能与NAFLD的发生发展有关,为进一步探究NLRP3炎症小体和脂联素相互之间关系提供了研究基础。