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骨骼肌由成肌细胞分化后形成的肌纤维组成,是畜牧生产中的主要消费形式,因此了解成肌细胞的分化过程对畜牧业中的肌肉产量十分重要。成肌细胞的分化过程受到十分复杂的网络调控,其中主要包括肌肉调节因子（Muscle Regulatory Factors,MRFs）及多种信号通路。越来越多的研究表明,DNA去甲基化参与肌肉发生过程并在其中发挥重要作用,但关于DNA去甲基化具体调控成肌细胞分化过程的研究较少。本文主要探究Tet2（Ten-eleven translocation 2）对鸡胚成肌细胞分化过程的影响和调控机制。本研究以鸡胚原代成肌细胞为模型,首先分析了 DNA甲基转移酶家族（Dnmts）和DNA去甲基转移酶家族（Tets）在鸡胚成肌分化过程中的表达情况,发现Tet2在成肌分化中发挥重要作用。其次,通过设计siRNA敲减Tet2在成肌细胞中的表达,研究Tet2在鸡胚成肌细胞发育过程中的作用。最后,研究敲减Tet2对5-AZA和VC促成肌分化作用的影响。本研究为深入了解DNA去甲基化参与成肌分化和肌肉发育过程提供了重要的理论依据。结果如下:1.Tet2在鸡胚成肌细胞分化中的表达分析通过qRT-PCT检测Dnmts家族和Tets家族在鸡胚原代肌细胞分化过程中的内源性表达,结果发现在mRNA水平上,随着成肌分化Dnmt1显著降低（P<0.05）,而Dnmt3a显著性上调,Dnmt3b仅在第4天显著性上升（P<0.05）。Tet1、Tet2和Tet3表达量在成肌分化过程中均显著性上调,但Tet2基因上调水平最高,说明Tet2在成肌分化中发挥重要作用。Tet2表达量在成肌分化第0天至第4天持续升高,并在第4天达到峰值（P<0.01）,随后在第6天出现下降,但仍显著性高于分化第0天。Westernblot结果表明,在成肌细胞分化启动后,TET2表达量随成肌分化持续升高并在第6天达到顶点（P<0.01）,并且分化相关蛋白DESMIN和MyHC表达量均显著升高（P<0.05）。DNAdotblot和免疫荧光染色结果表明成肌细胞分化过程中基因组5hmC水平显著上升（P<0.05）。同时免疫荧光结果表明随着分化的进行组蛋白甲基化产物H3K9me2和H3K27me3水平显著下调（P<0.05）。这些结果表明Tet2在鸡胚胎期骨骼肌发育过程中高度表达,Tet2通过改变5hmC和组蛋白去甲基化水平调控生肌因子的表达进而调控成肌细胞分化过程。2.敲减Tet2对鸡成肌分化的影响构建三条不同位点的特异性识别鸡Tet2基因的siRNA片段转染鸡胚成肌细胞。qRT-PCR结果显示,在转染48h后,siTet2-3的敲减效率最高,为25.88%。敲减Tet2并诱导分化后,生肌因子Myf5、MyoG和Mrf4的mRNA表达量均显著降低（P<0.05）,分化相关基因DESMIN和MyHC的表达量也显著下调（P<0.05）。Western blot结果表明,siRNA转染成肌细胞后TET2蛋白表达量下降至8.66%,同时DESMIN和MyHC表达量下调至23.92%和34.81%（P<0.05）。免疫荧光结果表明TET2表达量下降后,成肌细胞融合受到抑制,肌管形成受阻且肌管中含有的肌核数目降低。DNA dot blot和免疫荧光结果表明5hmC的表达量减少,同时免疫荧光结果显示组蛋白甲基化产物H3K9me2和H3K27me3水平均显著上调（P<0.05）。结果揭示敲减Tet2能够降低5hmC、MRFs和分化相关蛋白的表达量,促进H3K9me2和H3K27me3水平上调,从而抑制成肌分化过程。3.敲减Tet2抑制5-AZA和VC的促成肌分化作用5-氮杂胞苷（5-AZA）通过抑制DNA甲基化进而提高DNA去甲基化水平促进成肌分化;维生素C（VC）可加强Tets家族功能直接提高DNA去甲基化水平促进成肌分化。选用浓度均为0、0.5、5、50μM的5-AZA和VC处理成肌细胞,qRT-PCR结果显示随着浓度的增加,二者对生肌因子表影响一致,即MyoD的mRNA表达量不断降低,并且在5-AZA和VC浓度均为5μM时显著降低（P<0.05）;MyoG和MyHC的mRNA表达量随着浓度的增加而上升,在5-AZA和VC浓度均为5μM时MyoG和MyHC的mRNA表达量显著高于对照组（P<0.05）。因此,确定5-AZA和VC的使用浓度为5μM。敲减Tet2后诱导成肌细胞分化的同时在培养液中分别加入5μM的5-AZA或VC,Western blot结果显示,添加5-AZA或VC显著提高TET2表达量（P<0.05）,然而在敲减Tet2后5-AZA和VC对TET2表达的促进作用被显著降低（P<0.05）;DESMIN和MyHC的表达量结果相似,即添加5-AZA或VC均显著提高二者的表达量（P<0.05）,但是敲减Tet2后5-AZA和VC对DESMIN和MyHC的上调作用被抑制。DNA dot blot和免疫荧光染色结果表明,添加5-AZA和VC后,5hmC水平均显著提高（P<0.05）,并且在敲减Tet2后5-AZA和VC对5hmC水平的提高作用被抑制。免疫荧光结果表明5-AZA和VC显著降低H3K9me2和H3K27me3水平（P<0.05）,并且在敲减Tet2后5-AZA和VC对H3K9me2和H3K27me3的抑制作用被解除。结果表明敲减Tet2能够改变5-AZA和VC对生肌因子、5hmC、H3K9me2和H3K27me3水平的作用,从而抑制5-AZA和VC的促成肌分化作用。本研究结果表明,Tet2通过上调5hmC和MRFs表达,提高组蛋白去甲化水平,从而促进鸡胚成肌细胞融合分化形成肌管。敲减Tet2减弱5-AZA和VC的促DNA去甲基化能力,降低DNA去甲基化和组蛋白去甲基化水平,进而抑制5-AZA和VC的促成肌分化作用。本研究为深入DNA去甲基化调控肌肉发育的分子机制提供了理论基础和技术手段。