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副结核(Paratuberculosis),也称为约翰氏病(Johne’sdisease),由鸟分枝杆菌亚种的副结核分枝杆菌(Mycobacteriumavium subspeciesparatuberculosis,MAP)引起,是一种重要且极为普遍的反刍动物疾病,造成严重的经济损失。但是由于该细菌分离纯化难度较大,至今还缺少中国MAP分离株及其基因组信息。巨噬细胞被认为是MAP感染早期的主要宿主细胞,巨噬细胞的凋亡直接影响着MAP在细胞内的存活情况。但是关于MAP感染巨噬细胞后是否会引起细胞凋亡尚不明确。牛结核病(bTB)是一种慢性传染性细菌疾病,主要在野生动物、家畜以及人类中发现。它是由牛分枝杆菌(M.bovis)引起,主要通过气溶胶感染。全世界约有10%的人结核病病例是由牛分枝杆菌引起的。M.bvis与MAP常常可以同时感染同一个牛场,但是关于这两种病原体混合感染的研究却相对较少。因此,研究MAP与M.bois混合感染的免疫机制可以为牛副结核病及结核病的防治提供科学依据。1.本研究首要任务是分离中国的MAP菌株。通过ELISA检测某省19个奶牛场的MAP抗体的阳性率,筛选阳性率高的奶牛场,追踪MAP抗体阳性的淘汰奶牛,进行组织病理学观察,用HPC处理直肠粪便进行MAP分离,通过抗染色进行纯度检测,通过PCR-REA的方法对MAP菌株进行分型,同时用高通量测序技术对MAP分离株进行全基因组测序,用SOAPdenovo对短片段进行组装,通过BWA对短片段进行匹配,用SAM工具筛选SNP和indel。使用MEGA制作进化树。本研究成功地从中国奶牛场中分离出两株MAP菌株,并确定了这两株菌株均为MAP-C,并且证明了中国MAP分离株2015WD-1和2015WD-2与国际参考株MAPK-10关系最密切。2.用不同MOI值(MOI=1,5,10)的MAP2015WD-1菌株感染巨噬细胞J774A.1,在感染后12h检测J774A.1的凋亡情况。结果表明,仅在MAP的MOI为10时,可以引起巨噬细胞的凋亡。因此,我们用MOI=10的感染复数感染J774A.1,使用内质网应激抑制剂4-PBA及内质网激动剂Tm预处理巨噬细胞,通过Western bloting、RT-PCR流式细胞术以及透射电镜等技术探究内质网应激是否参与了 MAP诱导的J774A.1的细胞凋亡。结果证明,MAP可以引起J774A.1的内质网应激,并且在用内质网应激抑制剂4-PBA预处理后,细胞凋亡减少,用内质网应激激动剂Tm预处理后,细胞凋亡增多,因而从正反两反面证明了内质网应激参与了 MAP诱导的凋亡。我们进一步研究了巨噬细胞的极化与内质网应激及凋亡的关系。用LPS、IFN-γ处理将J774A.1诱导分化为Ml巨噬细胞,用IL-4处理诱导分化为M2巨噬细胞,用MAP分别感染Ml和M2(MOI=10),在不同的时间点检测细胞凋亡及内质网应激情况。结果表明,M1比M2巨噬细胞更容易发生内质网应所介导的细胞凋亡。3.本研究构建了 MAP与M.bovis混合感染的小鼠模型,通过观察体重及死亡情况的变化以及组织病理学观察来评估MAP对小鼠感染M bovis进程的影响;通过ProcartaPlex Multiplex Immunoassay 检测小鼠在感染后 1,3 和 6 周血清中 TNF-α,IFN-γ,IL-1β,IL-2,IL-4,IL-5,IL-6,IL-9,IL-10,IL-22,IL-13,IL-27,IL-23,IL-12P70,GM-CSF,IL-18和IL-17A的浓度变化;通过流式细胞术来探究脾脏及肺脏中CD4及CD8T细胞亚群的比例及脾脏中Th1/Th2反应、记忆性T细胞表型及多功能性T细胞的比例;通过免疫组化方法探究小鼠单独感染M.bovis与混合感染MAP之间肺脏中IFN-β的表达情况。结果表明提前感染MAP,可以抑制M.bovis感染小鼠的进程。对其产生影响的机制探究发现,MAP+ M.bovis小鼠可以通过减少肺脏中IFN-β的产量、诱导CD4+T细胞的产生、增强Th1反应以及增加脾脏中多功能性CD4+T细胞的数量来延长小鼠的存活时间或降低死亡率。