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人乳突瘤状病毒(HPV)是一种无包膜20面体对称的环状双链DNA病毒,目前发现的有200多个亚型。流行病学和分子生物学研究表明,高危型HPV持续性感染是引发宫颈癌的主要因素。接种HPV疫苗、在高危型HPV感染的早期进行筛查和准确分型、及时进行干预治疗,是预防宫颈癌发生的有效途径。HPV分型检测在宫颈癌的早期筛查,术后追踪和随访,对细胞学检测结果分流、发现高危人群,指导HPV疫苗的研究和使用等方面都具有重要的指导意义。 目前常用膜反向杂交、微阵列杂交等HPV分型检测方法,检测通量和灵活性有限,数据质量和重复性不佳,还存在着杂交反应速度慢、流程复杂、耗时费力、对杂交条件的依赖度高等缺点,用于临床检测多有不便。 本文开发了一种基于数字编码悬浮芯片的HPV分型检测方法。这种悬浮芯片主要由二氧化硅构成,与多种有机试剂兼容,容易通过化学修饰在其表面偶联生物分子,特殊的二维编码策略赋予其强大的编码能力。相对传统的固相芯片,悬浮芯片比表面积大、近液相反应动力学、灵活性强等特点,使其检测灵敏度、重复性和检测的灵活性大大提高。为将其用于HPV分型检测,本研究设计开发了一种巢式非对称PCR策略,不需要复杂的优化即可扩增得到大量可用于杂交检测的单链DNA。利用多重-巢式-非对称PCR对HPV基因组DNA进行扩增,将扩增产物与偶联有不同HPV亚型特意性捕获探针的图形编码芯片混合物进行杂交,实现HPV的快速、高灵敏度、高通量分型检测。 引物间可能的错配和干扰使得常规多重PCR前期的引物设计和优化非常繁琐。我们开发了一种制造工艺简单、成本低廉的微滴阵列PCR扩增技术,使多重反应在互相独立的体系内进行,既能避免繁琐的引物优化设计,又能大大提高通量,实现多指标的同步检测。本研究设计、筛选了一批高特异性,不同亚型之间无交叉反应的引物对,利用基于平面微滴PCR技术的HPV分型方法,实现HPV的快速、高灵敏度、高通量分型检测。