目前,肿瘤仍然是危害公众健康的重大疾病之一,国际癌症机构2020年数据显示,中国是新发肿瘤排名第一的国家,严重影响人民的生命健康和生命质量,肿瘤的防治一直是社会密切关注的话题。放射治疗是肿瘤治疗的重要手段,辐射可以通过直接或间接的方式,造成细胞的DNA损伤,阻断细胞周期进程,激活细胞死亡通路,最终达到杀死肿瘤细胞的目的。有丝分裂灾难是细胞受到外源性刺激而诱发DNA损伤后清除受损细胞的一种方式,根据其能维持基因组的稳定性这一特征,在肿瘤细胞中诱导有丝分裂灾难的发生有望达到清除肿瘤细胞的目的。α-地中海贫血/精神发育迟滞综合征X染色体相关基因（α-thalassemia/mental retardation syndrome X-linked,ATRX）具有DNA损伤修复,维持染色体端粒的稳定性等生物学功能。本研究建立了稳定沉默ATRX的肿瘤细胞模型,探讨电离辐射对细胞增殖、细胞周期进程、有丝分裂灾难、凋亡和衰老等的影响及相关分子机制,为辐射对肿瘤细胞的杀伤效应提供新的解释,并为肿瘤治疗提供新的分子靶点。目的:探讨靶向沉默ATRX对电离辐射诱导的肿瘤细胞增殖、细胞周期进程、有丝分裂灾难、细胞凋亡和衰老的作用及分子机制,为辐射杀伤肿瘤细胞作用提供新的解释。方法:1.设计3条靶向ATRX的sh RNA序列（sh ATRX）,克隆到慢病毒载体p GIPz上,利用293T细胞包装慢病毒后感染p53突变型的乳腺癌细胞MDA-MB-231（mt-p53）、p53野生型的结肠癌细胞HCT116（wt-p53）和p53敲除的结肠癌细胞HCT116（null-p53）,设立非靶序列对照（sh Con）,利用免疫印迹（Western Blot,WB）法检测ATRX的蛋白表达,荧光显微镜下观察GFP表达,确定感染效率,选择一条沉默效率好的细胞系进行后续实验,命名为NC与ATRXlow。2.采用X-RAD 320i X深部辐照仪进行照射,照射条件为:电压180 k V,电流20 m A,靶皮距70 cm,剂量率1.02 Gy/min。3.采用5-乙炔基-2’-脱氧尿嘧啶核苷（5-ethynyl-2’-deoxyuridine,EdU）染色检测NC和ATRXlow的MDA-MB-231（mt-p53）、HCT116（wt-p53）和HCT116（null-p53）细胞经0、4和8 Gy照射后24 h的增殖变化。4.采用PI染色流式细胞术检测NC和ATRXlow的MDA-MB-231（mt-p53）、HCT116（wt-p53）和HCT116（null-p53）细胞经0、4和8 Gy照射后24 h,细胞周期及多倍体的变化,同时,利用WB法检测周期相关蛋白的表达。5.采用免疫荧光法观察NC和ATRXlow的MDA-MB-231（mt-p53）、HCT116（wt-p53）和HCT116（null-p53）细胞经0、4和8 Gy照射后24 h细胞核及纺锤体形态,利用WB法检测有丝分裂相关蛋白Cyclin B1、CDK1、Cyclin D1、CDK4、p53、Daxx和MDM2的表达。6.采用Annexin V-PE/7-ADD染色流式细胞术检测NC和ATRXlow的MDA-MB-231（mt-p53）、HCT116（wt-p53）和HCT116（null-p53）细胞经0、4和8Gy照射后24 h细胞凋亡率的变化,利用WB检测凋亡相关蛋白caspase 3和cleaved-caspase 3的表达。7.采用β-半乳糖苷酶细胞衰老检测试剂盒检测经0、4和8 Gy照射后24 h,NC和ATRXlow的MDA-MB-231（mt-p53）、HCT116（wt-p53）和HCT116（null-p53）细胞衰老阳性率变化。8.利用SPSS 24.0进行统计学分析。细胞增殖百分率、细胞周期分布百分率、细胞凋亡率和衰老细胞百分数均以x±s表示,经正态性检验均符合正态分布,多组间样本均数比较采用方差分析,组间两两比较采用独立样本t检验,P＜0.05即认为差异具有统计学意义;使用Graph Pad Prism 8软件绘制结果图。结果:1.沉默ATRX的细胞模型构建基于已有的靶向沉默ATRX序列,采用相同方法建立细胞模型。利用293T细胞收获慢病毒,感染MDA-MB-231（mt-p53）、HCT116（wt-p53）和HCT116（null-p53）细胞。采用Western Blot法检测ATRX蛋白的表达,结果显示3种细胞的亲本细胞和sh Con细胞,ATRX均高表达,而sh ATRX1、sh ATRX2和sh ATRX3细胞则均出现不同程度的降低,尤其以sh ATRX1细胞沉默效率最高。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（GFP）表达,确认慢病毒感染效率,荧光显微镜下出现较高的绿色荧光强度的细胞,说明GFP蛋白表达较高。以上结果证明,本研究成功地构建了靶向沉默ATRX的细胞模型,分别命名为NC和ATRXlow。2.沉默ATRX增强辐射诱导的细胞增殖抑制EdU染色后检测阳性细胞,结果显示:与0 Gy相比,4和8 Gy照射后24h,MDA-MB-231（mt-p53）、HCT116（wt-p53）和HCT116（null-p53）EdU阳性细胞的百分比均降低（P＜0.05）,且照射剂量越大,EdU阳性细胞越少;在相同照射剂量下,与NC细胞相比,ATRXlow细胞的EdU阳性率进一步降低（P＜0.05）,且相较于其他两种细胞,ATRXlow的HCT116（null-p53）细胞的增殖抑制更加明显。3.沉默ATRX对辐射后细胞周期进程的影响及机制（1）沉默ATRX增强辐射后细胞周期阻滞流式细胞术结果显示:与0 Gy相比,4和8 Gy照射后24 h,3种细胞处于G2/M期的细胞百分比增加（P＜0.05）,细胞发生G2/M期阻滞,且随着照射剂量的增加,G2/M期阻滞更明显（P＜0.05）。并且,在HCT116（wt-p53）细胞中,经过4和8 Gy照射,与NC组相比,ATRXlow细胞中G0/G1期与S期的细胞比例增加（P＜0.05）,发生了G1期阻滞和S相延迟,但是在MDA-MB-231（mt-p53）细胞和HCT116（null-p53）细胞中并未发现相似的变化。笔者推测,沉默ATRX通过调控p53的表达而造成了HCT116（wt-p53）细胞不同于其他两种细胞的周期阻滞状态。（2）沉默ATRX影响辐射后细胞周期蛋白的表达WB结果显示:与0 Gy相比,MDA-MB-231（mt-p53）和HCT116（null-p53）细胞中,G2/M期相关蛋白Cyclin B1和CDK1的表达在4和8 Gy照射后升高,4 Gy照射后表达更高,G0/G1期相关蛋白Cyclin D1表达在辐射后降低,CDK4的蛋白表达变化并不明显;在相同剂量照射下,与NC相比,ATRXlow的MDA-MB-231（mt-p53）和HCT116（null-p53）细胞中,Cyclin B1和CDK1的表达下降,cyclin D1的表达升高,CDK4的表达变化不明显。而在HCT116（wt-p53）细胞中,与0 Gy相比,4和8 Gy照射后,Cyclin B1、CDK1和Cyclin D1表达略有降低,而CDK4的变化不明显;在相同照射剂量下,与NC相比,ATRXlow的细胞中Cyclin B1、CDK1和Cyclin D1表达降低,而CDK4的变化不明显。（3）沉默ATRX增强p53蛋白的表达利用生物信息学网站Gene MANIA检索到ATRX与Daxx之间存在相互作用关系,而MDM2与Daxx和p53之间存在相互作用关系,笔者推测ATRX与p53之间可能存在调控关系,WB结果显示:辐射后ATRX、Daxx和MDM2的蛋白表达升高,MDA-MB-231（mt-p53）和HCT116（wt-p53）细胞中p53蛋白的表达升高;在沉默ATRX后,Daxx和MDM2的表达降低,但MDA-MB-231（mt-p53）和HCT116（wt-p53）细胞中p53蛋白表达进一步升高。4.沉默ATRX增强辐射诱导的细胞有丝分裂灾难（1）沉默ATRX诱导辐射后核分裂异常免疫荧光法观察辐射后细胞形态,结果显示:辐射后MDA-MB-231（mt-p53）细胞出现微核,ATRXlow的HCT116（null-p53）细胞中也观察到同样的现象,但是HCT116（wt-p53）细胞中未见到明显的细胞核形态异常。（2）沉默ATRX增强辐射诱导的细胞多倍体流式细胞术结果显示:4和8 Gy照射后,MDA-MB-231（mt-p53）和HCT116（wt-p53）细胞六和八倍体细胞百分比增加,且ATRXlow细胞增加的更明显（P＜0.05）;在HCT116（null-p53）细胞中,照射后八倍体细胞百分比增加,且ATRXlow细胞增加得更明显（P＜0.05）。（3）沉默ATRX对辐射后细胞纺锤体形态的影响采用免疫荧光法观察纺锤体形态,对纺锤体主要组成部分α-tubulin进行荧光染色,结果显示:在MDA-MB-231（mt-p53）细胞中,4和8 Gy照射后,细胞纺锤体发生异常,出现多极纺锤体;ATRXlow的MDA-MB-231（mt-p53）和HCT116（null-p53）细胞在4和8 Gy照射后出现多极纺锤体;但是在HCT116（wt-p53）细胞中,则未或少见异常细胞纺锤体。（4）沉默ATRX抑制辐射后Aurora B的蛋白表达染色体伴侣乘客复合物CPC对有丝分裂过程中基因组忠实的传递至关重要,Aurora B和CENPA是该复合物的重要组成部分,尤其是Aurora B,它对中心体的形成和定位起到关键作用,采用WB检测Aurora B及其重要底物p H3和CENPA的表达,4 Gy照射后,Aurora B、CENPA和p H3的表达升高,而8 Gy照射后三种蛋白的表达则稍降低;在相同照射剂量下,ATRXlow细胞中三种蛋白的表达均低于NC细胞。（5）沉默ATRX影响辐射后SAC的功能SAC是细胞有丝分裂中最后一个检查点,在分裂过程中起到重要监测作用,SAC功能失常与MC有直接关系,WB结果显示,与0 Gy相比,4 Gy照射后3种细胞CDC20和Bub1b的表达增加,而8 Gy照射后表达降低,MAD2在照射后蛋白表达无明显变化;而在相同剂量照射下,与NC相比,ATRXlow细胞的CDC20、Bub1b和MAD2蛋白的表达降低。5.沉默ATRX增强辐射诱导的凋亡流式细胞术结果显示:与0 Gy相比,MDA-MB-231（mt-p53）、HCT116（wt-p53）和HCT116（null-p53）细胞经4和8 Gy照射后细胞凋亡率明显增加（P＜0.05）;在相同照射剂量下,与NC相比,ATRXlow的MDA-MB-231（mt-p53）和HCT116（wt-p53）细胞的凋亡率更高（P＜0.05）,而ATRXlow的HCT116（null-p53）的凋亡率无明显变化。WB结果显示:与0 Gy相比,4和8 Gy照射后,3种细胞中凋亡相关蛋白caspase 3表达降低,cleaved-caspase 3的表达升高,与NC相比,ATRXlow细胞中蛋白表达变化更明显。6.沉默ATRX对辐射诱导的细胞衰老的影响采用β-半乳糖苷酶检测试剂盒检测辐射后细胞的衰老变化,结果显示:在HCT116（wt-p53）和HCT116（null-p53）细胞中,与0 Gy照射相比,4和8 Gy照射后1 d,β-半乳糖苷酶阳性细胞数开始增加（P＜0.05）,暗示细胞发生衰老,且照射的剂量越高,衰老的百分比越大,并在培养后第4 d达到峰值;与NC相比,ATRXlow细胞的衰老百分率明显降低（P＜0.05）;而在MDA-MB-231（mt-p53）细胞中,在4和8 Gy照射后连续培养4 d,衰老阳性细胞百分比与0 Gy相比并无明显差异,并且NC组与ATRXlow细胞之间也没有明显差异。结论:1.成功构建沉默ATRX的MDA-MB-231（mt-p53）、HCT116（wt-p53）和HCT116（null-p53）的细胞模型;沉默ATRX能够增强辐射诱导的增殖抑制,且HCT116（null-p53）细胞的抑制作用更明显;2.辐射诱导3种细胞发生G2/M期阻滞,而沉默ATRX则增强p53野生的细胞辐射后的G0/G1期阻滞和S相延迟,可能与ATRX通过Daxx/MDM2/p53负调控有关;3.电离辐射通过扰乱SAC功能诱导肿瘤细胞发生有丝分裂灾难,并且沉默ATRX能够增加辐射诱导的有丝分裂灾难;4.沉默ATRX能增强辐射后细胞凋亡,降低了辐射诱导的细胞衰老,特别是HCT116（wt-p53）细胞和HCT116（null-p53）的细胞衰老,可能与ATRX参与组成衰老相关异染色质病灶有关。