思茅松毛虫核型多角体病毒及全基因组分析

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松毛虫类害虫是我国重大森林害虫之一。思茅松毛虫Dendrolimus kikuchiiMatsumura属鳞翅目Lepidoptera枯叶蛾科Lasiocampidae松毛虫属Dendrolimus。目前防治该害虫以化学农药为主。杆状病毒具有很强的专化性,对环境和非靶标生物安全,是一种理想的病原微生物杀虫剂。世界上已有50多种商品化生产的杆状病毒杀虫剂用于农林害虫的控制。因此,寻找致病力强的杆状病毒来防治该害虫显得非常必要。目前,作者在云南思茅松毛虫重灾区采集到了一株新的思茅松毛虫核型多角体病毒,主要研究结果如下:1.思茅松毛虫核型多角体病毒(DekiNPV)形态学和毒力研究发现了一株新的思茅松毛虫核型多角体病毒,定名为DekiNPV。多角体呈不规则型,直径大小0.79~2.31μm(n=100),平均直径1.64±0.1μm,其表面凹凸不平,且有大量的长条形、圆形孔洞,长条形居多,大小(173.00~254.00)×(55.10~116.00) nm;一个多角体中有多个杆状病毒粒子,杆状病毒粒子长约(252.22~359.38)×(70.18~200.00)nm,两端钝圆或平截,其内含有1~9个核衣壳,大小(24.00~28.60)×(242.00~340.00)nm,平均大小25.80±0.86×265.00±12.66nm (n=50),为多粒包埋型。用浓度2.2×104~2.2×108PIB/mL5个浓度的DekiNPV接种于3龄思茅松毛虫幼虫发现,DekiNPV对3龄思茅松毛虫幼虫有很强的毒力;LT50随着浓度的降低而增长,分别为6.89、7.18、8.16、10.31和11.13d,LC50为1.72×105PIB/mL;3龄思茅松毛虫幼虫感染DekiNPV后第7d幼虫开始大量死亡,死亡高峰期为感染病毒后的第7~10d。对在实验室连续传四代后的DekiNPV进行超微结构观察发现,传代后的DekiNPV形态结构与原代一致,具有稳定性。2. DekiNPV基因组全序列分析分析了DekiNPV全基因组序列,DekiNPV基因组大小为141,454bp, C+G含量为48.04%。预测DekiNPV含有146个开放阅读框(ORF),其大小在150个核苷酸以上,并与其它ORF有最小的重叠。其中有133个DekiNPV的ORF与报道已测序的杆状病毒具有同源性,13个ORF为该病毒特有,占全基因组的12.4%。基于DekiNPV的29个杆状病毒核心基因构建了该病毒的进化树,进化分析发现DekiNPV属于鳞翅目杆状病毒Group Ⅰ组,与MaviMNPV、BomaNPV、BmNPV、PlxyMNPV、RoMNPV和AcMNPV亲缘关系近。DekiNPV基因组中含有16个保守的结构基因,DekiNPV基因组缺失P6.9和odv-e56。该基因含有抗凋亡基因iap-1,iap-2和iap-3。DekiNPV基因组含中有12个bro基因。DekiNPV分别与AcMNPV、BmNPV、ChchNPV、LdMNPV、MacoNPV-B、SeMNPV和XecnGV进行了基因对等比较分析,发现该病毒与AcMNPV和BmNPV表现出了最好的线性关系。同源区分析发现,DekiNPV中共有11个hr。3. DekiNPV的PCR检测方法根据DekiNPV特有阅读框ORF146设计两对引物建立PCR检测方法,用DekiNPV基因组DNA为模板扩增出了426bp和655bp片段,PCR产物经测序结果与引物选取片段大小一致。分别以两对引物对DekiNPV的基因组DNA、多角体进行检测,最小量检测均达到了0.8fg/mL DNA和5PIB/mL,在感病虫体内检测到了DekiNPV的存在。该方法具有灵敏度高、特异性强、早期检测等特点,可以用于DekiNPV寄主域、替代寄主和病毒在种群中动态变化等领域的研究。4. DekiNPV寄主域及其替代寄主的研究用11种鳞翅目昆虫(云南松毛虫Dendrolimus houi、马尾松毛Dendrolimus punctatus、文山松毛虫Dendrolimus punctatus wenshanensis、赤松毛虫Dendrolimus spectabilis、美国白蛾Hyphantria cunea、舞毒蛾Lymantria dispar、灰茶尺蠖Ectropis grisescens、棉铃虫Helicoverpa armigera、甜菜夜蛾Spodoptera exigua、小菜蛾Plutella xylostella和斜纹夜蛾Spodoptera litura)和两株昆虫细胞系[sf-9细胞和杨扇舟蛾细胞(CAF-clan II)]研究了DekiNPV的寄主域和替代寄主。研究发现DekiNPV具有很强的专化性,但DekiNPV可以诱发美国白蛾、云南松毛虫、马尾松毛、文山松毛虫和赤松毛虫体内潜伏性感染病毒。
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