二十碳五烯酸具有多种生理功能,广泛应用于医药食品保健品等领域,需求量大,但来源受限。寻找新的EPA来源并能工业化生产是目前的研究热点。本文利用组学技术对腐霉中EPA油脂合成代谢进行了系统研究,找到了EPA油脂合成的重要调控点及其关键酶基因,进一步建立了增强腐霉EPA合成关键酶基因表达的工程菌及其发酵工艺,显著提高了腐霉油脂中EPA含量,加快实现利用腐霉生产EPA产业化应用的步伐。取得的创新性研究结果如下：(1)通过对腐霉EPA发酵过程中脂肪酸代谢轮廓研究,揭示了腐霉EPA油脂合成代谢途径及其可能的限速步骤。已有研究表明,腐霉中存在n-3和n-6两条EPA合成途径,但两条路径对EPA合成的贡献还不清晰。对腐霉合成EPA油脂脂肪酸组成成分的动态变化分析,发现n-3途径中的α-亚麻酸含量(<0.23%)显著低于n-6途径的γ-亚麻酸(>1.11%),且没有检测到α-亚麻酸下游流向EPA合成的中间产物(C18：4,△6,9,12,15),而EPA含量与n-6途径中的产物ARA含量呈正相关。因此,推测腐霉中EPA主要来源于n-6途径,并由ARA转化形成。还发现,油酸、亚油酸以及ARA等中间产物在EPA油脂中有较多积累,推测可能是EPA合成的限速步骤,同时比较研究了ARA高产菌株在不同发酵条件下n-6途径脂肪酸组成及其关键酶基因表达变化,发现D9、D12、D6脱氢酶基因的高表达可显著促进硬脂酸、油酸、亚油酸转化及ARA大量合成,综合以上研究,初步证明硬脂酸、油酸、亚油酸及ARA转化是EPA大量合成的限速步骤,对应的转化酶D9、D12、D6、D17是限制其大量合成的酶。通过对不同温度及溶氧条件下的腐霉EPA脂肪酸组成成分分析,发现降低温度或提高溶氧均可通过促进油酸和亚油酸的转化,提高EPA含量,表明相应的转化酶(D12、D6)受温度和溶氧的调控。(2)通过对优化条件下的腐霉EPA发酵过程进行转录组及差异数字表达谱分析,进一步揭示了腐霉EPA油脂合成机理,并确定了调控EPA油脂大量合成的调控节点。通过转录组分析,获得了23,796个Unigenes,其中,长度大于1kb的Unigenes有3866个,能被nr注释的Unigenes有9,398个；GO功能分类表明,1,945个Unigene显著集中于6个GO term(catalytic activity、binding、metabolic process、cellular process、 cell、cell part); KEGG pathway分析表明,7,300个Unigenes被注释分配于158个KEGG pathways,且包含Unigenes个数最多的途径是初级代谢,其次是剪接体途径、氨酰-tRNA合成、脂肪酸合成等。以上结果反映了腐霉的基因表达情况及其基因功能分布特征,为全面深入研究腐霉EPA油脂合成机理提供了分子依据。通过比较腐霉不同发酵(48,100and148h)的差异表达基因,进一步揭示了腐霉EPA油脂合成机理。对差异表达基因的Pathway显著性富集分析,48h vs100h,亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸的合成、氨酰-tRNA的合成、类固醇合成、泛酸盐及辅酶A的合成途径明显富集；100h vs148h,苯丙氨酸代谢、次生代谢、糖酵解、脂肪酸代谢等合成途径明显富集,进一步对富集途径对应的差异基因表达量进行分析表明,强化亮氨酸等合成、泛酸和辅酶A的合成以及糖酵解中乙酰辅酶A的合成,弱化氨酰-tRNA等的合成,可调控促进腐霉EPA油脂积累。进一步发现了31个Unigene被标记为转录因子,其中,转录因子NF-Y被报道与脂肪酸合成相关,其在EPA油脂合成期即100h表达量最高,推测该转录因子可通过促进腐霉中脂肪酸合成基因表达来促进EPA油脂合成。进一步比较分析腐霉在不同发酵阶段与EPA油脂合成相关的具有差异表达量的基因,发现有48个与EPA油脂合成密切相关的基因,对基因表达量进行详细分析,确定D6脱氢酶、乙酰辅酶A羧化酶、延长酶和甘油二酯酰基转移酶(DGAT)、脂肪酸合酶等被确定为限制EPA油脂大量合成的主要关键酶。(3)构建了腐霉转基因工程菌,促进EPA产量提高。构建了转D6脱氢酶基因的腐霉工程菌,筛选获得两株阳性菌株腐霉D6-1和腐霉D6-2,其EPA含量与原始菌株相比分别提高16.18%和15.63%；构建了腐霉vgb基因工程菌,对阳性转化子腐霉V1的发酵过程进行优化,研究发现,在低转速(120r/min)下,腐霉V1中EPA含量较原始菌株提高了20.70%,说明在限氧条件下更有利于血红蛋白基因的表达。以上研究为构建多基因调控的EPA高产工程菌提供了参考。