研究背景和目的间充质干细胞是具有多向分化潜能的细胞群体.比如向成骨、成软骨、成脂方向分化。近年来间充质干细胞受到越来越多的关注。研究用于组织工程、干细胞治疗缺血性疾病。细胞疗法的出现给很多疾病带来了新的治疗方式。而作为主要细胞来源的脂肪来源干细胞具有较骨髓间充质干细胞更多的优势,比如获取容易、低损伤、扩增能力强等。因此,获取容易、大量、和多向分化能力使得脂肪来源干细胞广泛作为骨、关节、和肌肉的再生或者替代的种子细胞来源。间充质干细胞周围的氧气浓度对控制干细胞的潜能、增殖、分化起着重要作用。间充质干细胞通常载体外培养在常氧浓度下(21%02),但是这个氧气浓度与其在体内的自然生理条件下氧气浓度有较大的差别。为了在生理氧浓度下保持其生理功能,间充质干细胞所处的“龛”大部分处于2%-8%氧浓度环境中,甚至氧浓度更低。当细胞经过移植以治疗像心肌梗塞等情况时,间充质干细胞会突然经历一个急剧的氧气缺乏的过程。越来越多的循证医学证据表明干细胞治疗的失败通常与移植干细胞的过度丢失有关。比如经历一个急剧的缺血缺氧环境,在这个环境中有浓度较高的炎症因子、和由于氧化反应所致自由基的集聚。不同的氧气浓度培养的干细胞在决定细胞的存活中起着重要作用,同时也在细胞适应环境的过程中起着不可替代的作用。氧气浓度决定了细胞信号转导过程中细胞能量代谢的过程,影响着细胞的特性。因此提高间充质干细胞的存活率及活性成为目前急需解决的问题。考虑到此,预处理被认为是在缺血的恶劣环境中最有可能促进干细胞存活和保持功能的方法。尽管有些研究者已经通过直接添加生长因子或者通过病毒转录生长因子来促进干细胞的存活,但是通过病毒转录生长因子对于临床应用来其不安全性值得深入考虑,而外源性的生长因子代谢周期短,在体内很容易就被降解掉不能维持一个较长时间。因此在细胞在经历一个严峻的环境之前先经过一个非致死性刺激来保证其在恶劣环境下的存活。许多的研究已经证实了不管是药物的还是基因的改造都能够提高其移植入心肌梗塞后骨髓间充质干细胞的存活,低氧预处理是另外的一种可以采取的保护间充质干细胞的并可以运用于临床的方法。此实验研究证实了低氧预处理人脂肪来源干细胞能促进细胞的存活,并引起缺氧诱导因子(HIF-1α)的表达增高,同时其下游提高VEGF、bFGF的表达。进一步观察发现低氧预处理的人脂肪来源干细胞旁分泌效应增强促进内皮细胞的存活,并在体外表现出促血管生成效应。这两方面都是干细胞再生治疗的重要组成方面。尽管ASCs仍未能像SVF广泛应用于临床,但其有望在进一步研究之后给更多的缺血性疾病患者的治疗带来福音。我们相信在不久的将来低氧预处理是一个可以用于干细胞临床治疗的有效的工具。材料与方法1、人脂肪组织来源干细胞的分离及培养脂肪来自于22～45岁要求去除腹部及大腿多余脂肪行抽脂术的健康成人,供体无传染病及内分泌疾病,男女比例为1：2。共12例患者。均来自于南方医院整形外科门诊患者,术前签署知情同意书。利用酶消化法分离得到ASCs:将抽脂所得的脂肪用PBS反复冲洗3次,再用0.125%Ⅰ型胶原酶于37℃水浴消化30min,期间反复震荡3次。用与胶原酶消化后的混悬液等体积的完全培养液(高糖DMEM+10%胎牛血清+1%双抗)终止消化,200目滤网过滤,1200g离心5mmin以去除悬浮的脂肪细胞、脂滴等,去上清。将细胞沉淀用1ml的完全培养液重悬后,加入6倍体积的红细胞裂解液,混匀后室温下孵育6min,1200g/min离心5min,去上清,再以适量完全培养基重悬沉淀,接种于培养皿,再加入适量完全培养液,置于370C、5%CO2孵箱培养。细胞每3天换一次培养,每周以1：3的比例传代。培养至第二代P2时进行低氧预处理和常氧处理。2、低氧预处理脂肪来源干细胞将培养至P2代的ASCs以1：2的比例传代,接种至100mm培养皿内,12小时后放入低氧培养箱(1%氧气浓度、5%二氧化碳、其余氮气平衡)。低氧处理48小时后进行进一步的实验。3、低氧预处理的脂肪来源干细胞的生物学检测本实验对人脂肪来源干细胞预处理低氧预处理48小时后进行了和常氧培养48小时后的生物活性、增殖能力、细胞凋亡率及细胞周期的比较。同时用流式细胞仪对人脂肪来源干细胞的细胞表面标志进行了对比。三向分化实验在低氧处理48小时后进行,都采用21%的氧环境进行诱导培养。成脂诱导7天后用油红O对ASCs行成脂染色,成软骨诱导21天后用阿尔辛蓝行成软骨染色,成骨诱导21天后用茜素红行成骨染色,这些分化检测对比都是为了明确低氧预处理是否改变了细胞的分化潜能。4、低氧预处理人脂肪来源干细胞促进血管生成机制将低氧处理过程中的ASCs条件培养基取出,离心,之后利用ELISA检测培养基内血管内皮生长因子(VEGF)碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、肝细胞生长因子(HGF)的生长水平。同时qRT-PCR检测脂肪来源干细胞的的相应基因的表达水平。利用细胞划痕实验检测条件培养基内的细胞因子对细胞迁移的影响,低氧和常氧培养基内加入抗VEGF和bFGF抗体。利用生长因子减少型Matrigel基质胶及人脐静脉内皮细胞检测条件培养基对人脐静脉内皮细胞成管样结构的影响。5、统计学分析所有数据均使用SPSS13.0进行统计学分析,对于两组对比均采用T-test进行统计学分析,P<0.05为有显著统计学差异。6、结果1、低氧预处理的脂肪来源干细胞与常氧培养的脂肪来源干细胞无明显的形态学差异。2、低氧预处理的人脂肪来源干细胞具有更强的活性、增殖能力及抵抗低血清恶劣环境的能力。处于增殖期的细胞较常氧培养多、凋亡细胞比率较常氧组低。仍然高表达间充质干细胞相关表面标志如CD90/CD105/低表达内皮细胞表面标志CD31。保持良好的间充质干细胞的特性,仍然具有向脂肪细胞、成骨细胞及软骨细胞分化的能力。3、人脂肪来源干细胞条件培养基内ELISA检测三种促血管生成因子结果显示：VEGF和bFGF有统计学差异,但HGF无明显统计学差异。RT-PCR结果显示证实缺氧诱导因子(HIF-1α0、血管内皮生长因子(VEGF)碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)基因表达增高,而肝细胞生长因子(HGF)表达无明显差异。4、低氧预处理的人脂肪来源干细胞条件培养基对内皮细胞显示出较常氧培养的人脂肪来源干细胞更强的增殖活性及降低凋亡细胞的比率。5、低氧预处理的人脂肪来源干细胞的条件培养基较常氧组培养的条件培养基更有利于人脐静脉内皮细胞的迁移。中和VEGF、bFGF能明显的抑制内皮细胞的迁移。6、低氧预处理的人脂肪来源干细胞条件培养基能促进人脐静脉内皮细胞在基质胶上成管,利用抗VEGF、bFGF抗体中和后,其成管样结构得到抑制。7、讨论近年来,基于干细胞的包括细胞治疗及组织工程的再生医学给修复和维持器官功能提供了更多的治疗方法,但是在创伤及病理条件下,干细胞极低的存活率严重限制了干细胞的功能发挥。比如说在移植后四天内,移植进入体内的干细胞就丢失了。基于这个考虑如何提高干细胞抵御缺血缺氧、疾病等情况的能力成为国内外学者的研究热点。目前有研究者利用基因改造携带促血管化生长因子基因达到促进移植脂肪存活已经取得了不错的成果。另外Lee等利用携带局部携带促血管生长因子达到了治疗改善局部缺血、加强血流灌注目的。但是这两种方式对于临床应用的限制很多,基因改造后细胞的安全性不能得到保证,由病毒转染所带来的不可控性的免疫原性及基因突变。生理健康组织的氧体积分数大多都低于常氧(21%O2),在血流灌注率高的肺、肝脏、肾脏、和心脏中也不过4-14%。而间充质干细胞主要来源于脂肪和骨髓。脂肪和骨髓也处于低于常氧的环境中,骨髓的氧浓度在0-4%之间。重要的是,通常认为脂肪来源干细胞所处的生理环境氧浓度低于3%。脂肪来源干细胞以其大量、通过脂肪抽吸术获取容易、多向分化潜能在再生医学细胞来源方面拥有广泛的应用潜力。随着近年来对脂肪来源干细胞的进一步研究发现脂肪来源干细胞容易扩增并且不仅能够向间充质细胞方向分化,同时也能分化向造血和神经细胞方向。因此作为一个通过局部麻醉和给病人带来很少创伤就能获得大量细胞的间充质干细胞来说,脂肪来源干细胞在再生治疗方面拥有广阔的前景。通常组织的损伤伴随着缺血和缺氧的发生,在这过程中由于氧化反应产生大量的自由基,这些是对间充质干细胞的治疗很有害。因此,了解脂肪来源干细胞对缺氧的反应就显得尤为重要了,另一方面是低氧是一个有利于促血管生成的因素,利用其促血管效应分泌细胞因子来促进间充质干细胞促血管生成效应的发挥。在此实验中我们揭示了低氧预处理的脂肪来源干细胞具有较常氧培养的脂肪来源干细胞相似的形态学表现,较常氧培养的脂肪来源干细胞更强的增殖能力和细胞活性,甚至在低血清的恶劣环境下表现出较常氧组脂肪来源干细胞更高的细胞活性和更少的凋亡细胞。同时流式细胞仪检测结果表明低氧预处理的脂肪来源干细胞具有和常氧处理的脂肪来源干细胞相似的高表达间充质干细胞表面标志CD90和CD105、低表达内皮细胞表面标志CD31。同时我们低氧预处理对脂肪来源干细胞有一个促增殖的效应。在低氧组有更多出于S期的细胞。低氧预处理的脂肪来源干细胞具有和常氧培养的脂肪来源干细胞相同是能多向分化的能力。低氧已经被证实了能够调节细胞的许多过程和信号转导通过缺氧诱导因子1的表达。氧气浓度决定缺氧诱导因子1α的活性。我们的实验证实了在低氧组低氧促进了缺氧诱导因子1α及其下游基因血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子的表达,这两个因子在血管形成早期起着重要促血管生成的作用。另外的研究也证实了低氧能够促进骨髓间充质干细胞中血管内皮生长因子基因的表达。另外我们对条件培养基对血管内皮细胞的作用进行了研究。我们选取了血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子这三个在血管发生过程中起着重要作用的因子,并且它们能由脂肪来源干细胞分泌。我们的研究发现低氧预处理的脂肪来源干细胞能够促进血管内皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞因子的分泌。而肝细胞生长因子无明显变化。在先前的研究中已经被证实了,脂肪来源干细胞能够促进内皮细胞的增殖和活性。因此,我们对低氧预处理的脂肪来源干细胞的条件培养基和常氧培养的脂肪来源干细胞条件培养基进行对内皮细胞的培养,了解其对内皮细胞的作用。我们发现内皮细胞在低氧培养基内较常氧培养基内具有更高的增殖并减少了内皮细胞的凋亡。在基质胶上混合着低氧预处理的脂肪来源干细胞的条件培养基较常氧培养基的人脐静脉内皮细胞能形成更多的毛细血管样结构,抗血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞抗体中和后能明显抑制内皮细胞的迁移和内皮细胞在基质胶上形成的毛细血管样结构。添加抗血管内皮生长因子抗体后形成的毛细血管样结构较添加碱性成纤维细胞生长因子的抗体少,表明在促进人脐静脉内皮细胞形成管腔样结构时,血管内皮细胞生长因子起着较碱性成纤维细胞生长因子更重要的作用,虽然二者都对血管形成起着重要作用,结果表明血管内皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子在促进和修复血管中起着重要作用。外源性和环境因素,比如参与炎症反应因子可能引起细胞的死亡。因此提高移植细胞的存活成为了加强干细胞治疗有效性和效率的关键。很多手段已经被用来提高移植干细胞的存活。为了脂肪来源干细胞应用于病人,亟需要改善这些细胞促血管生成效应。脂肪来源干细胞能够分泌促血管生长因子和抗凋亡生长因子,并且低氧预处理能够促进这些细胞因子的表达。低氧预处理是一种可以让细胞抵御移植后缺血环境的处理手段,这种手段能够同时促进移植细胞和原有细胞的存活。低氧预处理的脂肪来源干细胞在临床上治疗缺血性疾病中拥有广阔的前景。我们相信也许在不久的将来低氧预处理将会是一个对临床干细胞治疗起着非常重要作用的手段。低氧浓度张力是干细胞微环境的重要组成部分,有利于提供维持干细胞相关功能的信号。研究表明,在生理氧张力范围下培养间允质干细胞能促进其增殖。Lennon等在低于5%的氧浓度中培养小鼠的间充质干细胞,发现其增殖率相对常氧下培养大约多出40%。Yang及Valorani等的实验也得到类似的结论。所以低氧预处理间充质干细胞在组织工程机细胞疗法方面拥有广泛的前景。但目前对于低氧预处理的氧浓度、及时间未形成广泛的共识。氧浓度从0.5%-10%,处理时间从24h到72h。从而得出了不完全一致的结果,但是主要研究结果表明,低氧预处理间充质干细胞能促进间充质干细胞的生物活性,但是对于细胞分化潜能方面存在较大争议。本实验采取1%氧浓度预处理脂肪来源干细胞,使细胞更接近于其体内的正常生理环境。本实验证实了低氧预处理能促进脂肪来源干细胞增殖、细胞活性、且能维持脂肪来源干细胞的间充质干细胞特性,从而为脂肪来源干细胞进入体内发挥更好的生物学效应提供了更为有利的条件,但是,低氧预处理脂肪来源干细胞的氧浓度及处理时间需要进一步的深入研究及规范,从而为提高干细胞移植效率提供新的实验和理论依据。8、结论1.低氧预处理的人脂肪来源干细胞具有与普通氧浓度培养的脂肪来源干细胞相似的形态学特征。低氧预处理的人脂肪来源干细胞较常氧培养的人脂肪来源干细胞具有更强的增殖率、更高比率的处于增殖期的细胞、在低血清环境下具有更少的凋亡细胞、更高的生物活性。低氧预处理的人脂肪来源干细胞仍然高表达CD90/CD105等间充质干细胞表面标志。低表达CD31等内皮细胞的标志。并且具有成脂、成骨、成软骨的三向分化潜能。2、低氧预处理的人脂肪来源干细胞较常氧培养的人脂肪来源干细胞分泌更多的促血管生成因子比如血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子。同时qRT-PCR结果证实了低氧环境诱导缺氧诱导因子HIF-1α表达增高继而导致其下游促血管生成因子：血管内皮生长因子及碱性成纤维细胞生长因子基因表达的增高。而肝细胞生长因子基本没有受到低氧预处理的影响而表达发生改变。这些结果表明低氧预处理对人脂肪来源干细胞的保护作用至少一部分是由于低氧导致的血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子分泌增多引起。3、低氧预处理人脂肪来源干细胞的培养基较常氧培养的培养基更能促进人脐静脉内皮细胞的活性及减少细胞凋亡。4、低氧预处理的人脂肪来源干细胞的条件培养基能较常氧培养基更能促进人脐静脉内皮细胞的迁移,利用抗血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子抗体在低氧组培养基内中和后,其迁移受明显抑制。同样,我们在常氧组培养基内也观察到抗血管内皮生长因子及碱性成纤维细胞生长因子抗体能抑制内皮细胞的迁移。低氧预处理的人脂肪来源干细胞的条件培养基能较常氧培养基更能促进人脐静脉内皮细胞在Matrigel上成管,利用抗血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子抗体中和后,其成管效应减弱。低氧预处理是一个有效的并且能够用运用于临床的预处理手段,能很好的保持间充质干细胞的特性并通过分泌更多的促血管生成因子达到改善局部自身存活及促进周围组织功能恢复的目的,在不久的将来必将成为干细胞治疗的有效手段。