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ATP(三磷酸腺苷)是机体生命活动重要的能量通货,动物体内ATP的合成主要在线粒体中通过氧化磷酸化途径来完成。参与氧化及磷酸化的体系以复合体的形式分布在线粒体的内膜上,构成电子传递链(呼吸链),其本质是一个氢氧化为水的放热反应,即三羧酸循环产生的还原型NADH和FADH2提供氢原子,然后在线粒体内膜上经过一系列的氧化还原反应释放自由能,定位于线粒体内膜上的ATP合酶再利用这些能量在跨膜的质子转移驱动反应中催化ADP(二磷酸腺苷)磷酸化形成ATP。ATP合酶是一个由酶复合体,主要由三个主要单元构成,分别是FO和F1,另外还有一部分亚基构成连接两部分的外周柄。根据结合变构机制理论:质子流通过ATP合酶Fo单元的同时,β亚基构象改变为开放状态,使ATP从酶分子上解脱下来。保幼激素(Juvenile hormone,JH)是昆虫体内的重要内分泌激素之一,在咽侧体(CA)中合成,与另一个重要的内分泌激素即蜕皮激素(20-hydroxyecdysone,20E)共同调控昆虫的生长与发育。JH的滴度高峰出现在幼虫每个龄期的初期,促进物质代谢,维持幼虫生长;20E负责启动幼虫蜕皮及化蛹与化蛾变态蜕皮。尽管JH和ATP合酶都参与调节生长发育过程,但两者之间是否存在联系还不清楚。家蚕是重要的产丝经济昆虫,是昆虫遗传与生理研究的模式生物之一。本研究通过对基因组和转录组数据的比较分析,鉴定获得了家蚕基因组中的ATP合酶亚基基因,并建立了这些基因的时空表达谱;以此为基础,进一步在细胞、组织和个体水平探究了JH对ATP合酶亚基基因表达及ATP合成的影响。获得的主要研究结果如下:1.家蚕ATP合酶亚基基因的基因组鉴定以果蝇的ATP合酶亚基编码基因的氨基酸序列在两个家蚕基因组数据库SilkDB(http://www.silkdb.org/silkdb/)及KAIKObase(http://sgp.dna.affrc.go.jp/KAIKObase/)中进行同源性检索,鉴定家蚕ATP合酶亚基基因。基于序列相似性及功能域保守性,我们从家蚕基因组中鉴定获得了13个核基因组编码的家蚕ATP合酶亚基基因。进一步的生物信息学分析显示,家蚕ATP合酶亚基基因的外显子数从1(ATPB)到10(ATPA)不等;除了ATPE外,家蚕其他ATP合酶亚基基因都能定位到特定染色体上;家蚕ATP合酶亚基的氨基酸序列长度从61(ATPE)到553(ATPA)不等,各个亚基含有不同的结构域。比较基因组学分析发现,这13个ATP合酶亚基基因在家蚕、果蝇、帝王蝶、蜜蜂和赤拟谷盗等昆虫中都是单拷贝;但在小鼠和人类中,AT91有3个拷贝。系统发生分析显示,不同昆虫中同一个单拷贝ATP合酶亚基基因的同源体总是聚成一类,而小鼠和人的另聚成一类。有趣的是,人和小鼠中AT91基因的每一个拷贝总是先聚成一类,再与另外拷贝的聚类分支聚类,暗示AT91的多拷贝形成发生于人类和小鼠分化之前。2.家蚕ATP合酶亚基基因的时空表达谱分析我们对家蚕ATP合酶亚基基因的时空表达谱进行了分析。首先,通过分析雌雄家蚕幼虫5龄第3天各组织的全基因组表达谱芯片数据发现,ATP合酶各亚基的表达模式基本相似,主要在中肠和马氏管等代谢型组织及头部中高表达,在代谢型组织表皮中的表达水平次之。其次,通过分析变态发育过程中脂肪体组织的转录组数据发现,幼虫5龄第3天脂肪体组织中的ATP合酶亚基有一定表达,但在化蛹后第3天的表达水平很高。最后,分析家蚕个体从幼虫5龄第4天到化蛾整个变态发育期的全基因组表达谱芯片数据发现,ATP合酶亚基主要在幼虫5龄、及化蛹后高量表达。综合分析上述结果发现,家蚕ATP合酶各亚基主要在幼虫生长及蛹向成虫的变态发育中高表达,而在幼虫期又主要在代谢型组织中高表达,这基本与家蚕生长发育过程中代谢活动活跃的时空特异趋势相吻合。3.JH影响家蚕ATP合酶亚基基因ATPO的表达及ATP的合成我们探究了JH对家蚕ATP合酶亚基基因表达的影响。用JH类似物(JHA)处理家蚕胚胎来源的BmE细胞和离体培养的家蚕表皮组织,继而利用定量RT-PCR分析ATP合酶亚基的表达变化,结果显示JHA处理导致ATPO亚基基因的表达显著上调;用JHA注射家蚕个体同样能促进表皮中ATPO的表达。进一步的定量RT-PCR分析结果表明,在家蚕幼虫4龄起蚕到5龄末期的表皮中,ATPO主要在4龄前期高表达,5龄初期的表达水平次之,这与家蚕血淋巴中JH的滴度变化模式一致的。这些结果暗示JH对ATPO的转录起正调控作用。我们进一步分析了JHA处理对家蚕ATP合成的影响。结果显示,不论是JHA处理BmE细胞还是注射家蚕个体,都能促进ATP的合成。在家蚕BmE细胞中过表达JH信号传导分子Kr-h1,导致ATPO的表达显著上调,ATP含量显著增加。在家蚕卵巢来源的BmN4-SID1细胞中对ATPO亚基基因进行RNAi,结果发现,ATPO基因的RNAi导致ATP合成降低。综上,我们推测JH通过促进ATPO亚基基因的表达来促进ATP的合成。