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目的:Smad3是肝纤维化进程中的TGF-β/Smads途径的一个重要蛋白,Smad3是介导TGF-β信号向细胞内传递、活化肝星状细胞的直接承担者,在肝纤维化发展进程中起着关键作用。本文以Smad3基因为研究对象,构建筛选出该基因的有效siRNA干扰载体,并初步探讨糖基转移酶ppGalNAc-T家族与Smad3基因之间的相互关系。方法:遵循RNA干扰目标序列的选取原则,利用互联网资源对Smad3基因mRNA序列设计三条可能的小干扰RNA(siRNA),分别将这三段siRNA插入到RNA干扰真核表达载体pRNAT-U6.1/Neo中构建成三条干扰载体;脂质体介导三条载体转染至肝星状细胞,采用RT-PCR的方法筛选出其中一条对Smad3抑制作用最佳的载体,RT-PCR和Western-Blot进一步鉴定该载体对Smad3的抑制作用;接下来利用已构建筛选出的pRNAT-SiSmad3转染肝星状细胞,建立Smad3的下调表达模型,检测糖基转移酶ppGalNAc-T家族的表达情况,同时利用本实验室已经构建的干扰表达载体pSilenCircle-SiT2转染入肝星状细胞,建立下调表达ppGalNAc-T2的细胞模型,再检测Smad3基因的表达。进而初步探讨Smad3与糖基转移酶ppGalNAc-Ts基因家族的关系。结果:成功构建三条Smad3的siRNA表达载体,并筛选出其中一条对Smad3基因抑制效率较高的siRNA表达载体。检测出转染了该有效siRNA表达载体的肝星状细胞中Smad3的mRNA和蛋白表达都受到了有效抑制,而糖基转移酶ppGalNAc-Ts的mRNA表达也随之发生了一些变化。同时,在ppGalNAc-T2下调表达的细胞中,Smad3在mRNA水平和蛋白水平表达几乎没有变化。结论:成功筛选到一个Smad3基因的siRNA干扰载体,继而可转染人肝星状细胞,并抑制其中Smad3蛋白的表达,为研究SiRNA方法在肝纤维化中的治疗作用提供实验基础和理论支持。另外,下调表达Smad3后,ppGalNAc-Ts家族的mRNA表达受到了一些轻微影响;而在ppGalNAc-T2下调表达的细胞中,Smad3的mRNA水平和蛋白水平几乎没有变化,这表明:可能ppGalNAc-T与Smad3甚至肝纤维化的信号途径并无直接关联或者是相关性极小。至于其它的糖基转移酶家族是否与TGF-β/Smad3信号转导途径存在着某些尚且未知的联系?这还有待进一步的深入研究。