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近年来在水产养殖领域，迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）的危害日益突出，已成为水产养殖中重要病害之一，建立快速、准确检测E.tarda方法是进行有效防治的基础和先决条件。本研究建立了E.tarda的荧光定量PCR和环介导等温扩增检测方法，并进行了临床检测应用，以期为E.tarda的快速诊断提供有效的方法。本研究还进行了E.tarda疫苗的初步研究，比较了不同灭活方法和免疫增强剂对E.tarda灭活疫苗的免疫效果的影响，最终确定了一种具有较好免疫效果的E.tarda疫苗并进行了应用试验。另外还构建了E.tarda双基因缺失突变株，为后续E.tarda功能基因组学及减毒活疫苗的相关研究提供基础。本研究主要结果如下: 1.迟缓爱德华氏菌荧光定量PCR检测方法的建立和应用 根据E.tarda16S rRNA和溶血素基因序列，设计引物和TaqMan荧光探针，通过对反应条件进行优化，建立了用于检测E.tarda的双重FQ-PCR和16S rRNA单探针FQ-PCR。以E.tardaDNA为模板，该双重荧光定量PCR的检测极限可达到4fg/反应。16S rRNA单探针FQ-PCR中以构建的质粒标准品为模板其检测极限可达到50 copies/反应，较常规PCR提高100倍。对所构建的16S rRNA基因质粒标准品核酸拷贝数(C/5，x)的对数值与其对应Ct值(y)进行相关性分析，可得到标准曲线:y=-3.2798x+39.635(R2=0.9989)。批内与批间分析结果表明，所建立的FQ-PCR方法具有较好的重复性。双重FQ-PCR特异性检测结果中与6种海水弧菌无交叉反应，也可区别同属中的鲇鱼爱德华氏菌（Edwardsiella ictaluri）。研究结果表明，该方法灵敏，特异、准确、重复性良好且能实现E.tarda的定量检测，对E.tarda的临床检测和疫情监测具有重要意义。 2.迟缓爱德华氏菌环介导等温扩增(LAMP)检测方法的建立和应用 根据E.tarda的16S rRNA、EsrB和溶血素基因序列设计引物，建立E.tarda的LAMP检测方法。对16S rRNA和EsrB基因的LAMP反应体系中适宜Mg2+浓度、反应温度、反应时间进行优化，以质粒标准品为模板，灵敏度检测结果表明16S rRNA和EsrB基因的LAMP方法检测极限为10拷贝，较传统PCR提高100倍。特异性检测结果表明，EsrB基因的LAMP检测方法与6种弧菌无交叉反应，但与E.ictaluri有交叉反应。溶血素基因的LAMP检测方法特异性强，与E.ictaluri及6种弧菌无交叉反应。LAMP检测方法可在40min-1h即可完成，对仪器设备要求低，为E.tarda检测提供了一种快速简便的分子生物学方法。 3.不同灭活方式及免疫增强剂对迟缓爱德华氏菌免疫原性的影响 本研究比较了甲醛、戊二醛、热处理、超声、反复冻融及碱处理方式制备E.tarda灭活疫苗对斑马鱼相对保护率(RPS)，结果表明甲醛灭活疫苗具有相对较高的免疫保护效果，以此为基础进行了E.tarda灭活疫苗中添加不同免疫增强剂的应用实验，确定了黄芪皂苷（20μg/Fish）与甲醛灭活E.tarda疫苗(106CFU/Fish)配伍腹腔接种斑马鱼具有相对较高的免疫效果，在免疫30天后，以10倍LD50剂量腹腔注射感染，28天后的RPS为52.3％，这一结果为下一步实验提供参考。 4.黄芪皂苷增强迟缓爱德华氏菌灭活疫苗免疫作用的研究 将不同浓度的黄芪皂苷添加于甲醛灭活的E.tarda中，腹腔注射免疫斑马鱼（10uL/尾），30天后用10倍LD50剂量进行人工感染E.tarda实验，连续观察28d，用实时定量PCR比较实验各组在感染后0h、1h、2h、4h、6h、24 h斑马鱼TNFα和IL-1β的表达差异，结果表明除个别时间点外，各实验组总体来说较对照组TNFα、IL-1β的表达量有着不同程度的提高。其中灭活疫苗中添加5mg/mL黄芪皂苷组的TNFα和IL-1β转录水平在感染后6h均达到最高值，较对照组、注射2mg/mL黄芪皂苷组、甲醛灭活疫苗组，TNFα转录水平分别约提高了32倍、15倍和2.5倍，IL-1β转录水平分别约提高了9倍、4倍和0.8倍。两基因均在感染后24h表达量有所下降，但仍然明显高于其余各组。注射黄芪皂苷2mg/mL、灭活疫苗及灭活疫苗中添加1、2、5、8、10mg/mL的黄芪皂苷组较对照组均可显著降低死亡率(P＜0.05)，添加5mg/mL的黄芪皂苷组的RPS显著高于实验各组，为73.8％(P＜0.05)。实验中灭活疫苗中黄芪皂苷的添加量在5mg/mL范围内时，黄芪皂苷的添加量与斑马鱼在感染E.tarda后6h的TNFα表达量及RPS间具有正相关性。根据以上实验结果，对大菱鲆（Scophthatmus maximus）腹腔注射100uL/尾，进行应用实验，免疫4周后，以1.35x104 CFU/fish腹腔注射进行E.tarda人工感染实验，连续观察14d，结果表明注射黄芪皂苷5mg/mL组、灭活疫苗组及灭活疫苗中添加2、5、8mg/mL的黄芪皂苷组较对照验组均可显著降低死亡率（P＜0.05），灭活疫苗中添加5mg/mL黄芪皂苷组的RPS显著高于实验各组，为60.6％(P＜0.05)。与斑马鱼实验一样，灭活疫苗中黄芪皂苷添加量在5mg/mL范围内时，RPS随黄芪皂苷添加量增加而增加，两者关系呈正相关。本研究是黄芪皂苷作为免疫增强剂在水产研究领域的首次报道，为黄芪皂苷药理学研究及其在水产上的应用提供基础数据，也为E.tarda的疫苗控制技术研究提供参考及理论依据。 5.迟缓爱德华氏菌EsrB、EvpC双基因缺失突变株的构建 本研究通过pRE112质粒，利用基因同源重组的原理，首先构建不含任何外源的标记和外源基因片段的E.tardaⅢ型分泌系统中EsrB基因和Ⅵ型分泌系统中EvpC基因缺失突变株，以斑马鱼为模式动物验证EvpC基因缺失对毒力的影响，结果表明EvpC基因缺失突变株较原E.tarda其LD50提高了71倍。以此为基础，首次构建了E.tarda EsrB和EvpC双基因缺失突变突变株，为后续E.tarda功能基因组学及减毒活疫苗的相关研究提供基础。