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口服给药是兽医临床上重要的给药途径之一,而口服给药发挥药物疗效的前提是药物能透过胃肠道细胞膜进入体循环。研究表明小肠上皮细胞膜上高表达的P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)可以限制药物的口服吸收,降低口服药物生物利用度。因此筛选安全有效的P-gp抑制剂以提高口服药物生物利用度已成为药物制剂学领域的研究热点。黄连素是常用的抗感染治疗药物。已有研究表明黄连素对大鼠P-gp表达和功能具有一定影响,但也未深入研究,而黄连素对肉鸡组织中P-gp表达及功能的影响尚未见报道,有待进一步研究。因此本实验研究了黄连素对肉鸡小肠组织P-gp表达和功能的影响,并初步探讨了黄连素引起P-gp表达变化与核受体CXR、CAR和PXR的相关性。本实验首先克隆了 AA肉鸡Abcb1全序列,并采用生物信息学软件分析了该基因编码蛋白的跨膜结构、糖基化位点,绘制物种间的进化树。酶切和测序的结果证实鸡的Abcb1基因被成功克隆并被重组至质粒pcDNA3.1中。生物信息学分析显示:肉鸡Abcb1基因的CDS全长为3867 bp,编码1288个氨基酸,与火鸡、鸭、人、猪、牛和羊的氨基酸序列同源性较高,分别为95%、74%、72%、72%、68%和72%。PROTTER软件预测肉鸡Abcb1编码蛋白P-gp的跨膜结构,发现其与人P-gp结构相似,均有12个跨膜螺旋,分为两个跨膜区和两个胞内的核苷酸结合区。糖基化位点预测显示肉鸡P-gp可能存在7个潜在的糖基化位点,而人P-gp可能存在10个。进化树分析显示鸡与火鸡的P-gp同属一个分枝,而与人和其他哺乳动物如猪、牛的进化关系较远。然后我们采用脂质体转染方法构建高表达肉鸡P-gp的MDCK-chAbcb1细胞系,并对其转运功能和特性进行了研究。实验通过Lipfactamine 2000转染试剂将构建的pcDNA3.1-chAbcb1真核质粒导入MDCK细胞中,选用潮霉素B进行筛选获得单克隆细胞株。采用RT-PCR、免疫组化和免疫荧光对细胞中P-gp的mRNA和蛋白表达水平进行检测和分析,最后通过Rho123的蓄积和转运实验对构建细胞系的转运功能进行鉴定。RT-PCR结果显示构建的过表达MDCK-chAbcb1细胞中能检测到肉鸡Abcb1的mRNA表达,免疫组化和免疫荧光结果显示P-gp (Abcb1编码蛋白)定位于细胞膜上,且P-gp在MDCK-chAbcb1细胞中的表达量较MDCK-pcDNA3.1细胞显著升高(约3倍)。Rho123蓄积实验实验结果显示其在MDCK-chAbcb1中的荧光强度显著低于MDCK-pcDNA3.1细胞,尤其在孵育10、20和50min后差异极显著(P<0.01),而与Caco-2细胞中的蓄积量相比,略有升高,但无显著差异(P>0.05)。采用P-gp抑制剂维拉帕米作用后,Caco-2和MDCK-chAbcb1细胞内Rho123的蓄积量均随时间延长而显著升高,且在20和50 min时差异显著(P<0.05),而MDCK-pcDNA3.1细胞中Rho123蓄积量未见显著变化(P>0.05)。进一步比较了肉鸡和人P-gp对Rho123转运特性,发现MDCK-chAbcb1对Rho123存在两个亲和位点,米氏常数(Km)分别为0.73±0.03和51.75±9.20μM,最大转运速率(Vmax)分别是0.87±0.05和10.14±1.10 nmol/mgprotein/min。Caco-2细胞对Rho123只有一个亲和位点,米氏常数和最大转运速率分别为 2.38±0.06 mM 和 22.8±2.74 pmol/mg protein /min。Caco-2 和 MDCK-chAbcb1 细胞对Rho123 的Pappb-a 分别为 72.33±4.48 和 54.42±4.36,显著高于对照 MDCK-pcDNA3.1 细胞(11.35±1.81 ),外排率ER分别为7.49和6.24,也显著高于对照MDCK-pcDNA3.1 (1.64 )。上述结果证实肉鸡P-gp在MDCK-chAbcb1细胞中高表达,其与底物Rho123的结合特性与Caco-2细胞存在差异,但其转运Rho123的能力与Caco-2的转运能力相当。在上述实验基础上,本研究进一步采用跨膜转运实验结合高压液相色谱方法比较了维拉帕米和黄连素对Caco-2和MDKC-chAbcb1细胞P-gp转运功能的影响。结果显示维拉帕米(0.01-5 mM)作用Caco-2和MDKC-chAbcb1细胞后,Rho123从基底侧(BL)到顶侧(AP)的转运均受到抑制,且呈现浓度依赖性,而从AP侧到BL侧的转运量虽有升高趋势,但无显著性变化(P>0.05)。其中0.1、1和5 mM的维拉帕米对MDKC-chAbcb1细胞外排Rho123的抑制率分别为43.8%、68.9%和78%,对Caco-2细胞外排Rho123的抑制率分别为45.7%、61.1%和71.4%。不同浓度的黄连素(5、20和40μM)处理MDCK-chAbcb1细胞不同时间后,Rho123从BL到AP侧的转运均受到抑制,并且随着抑制时间延长,其对Rho123外排抑制率也逐渐升高。上述结果表明,P-gp的经典抑制剂维拉帕米对肉鸡P-gp同样具有较好的抑制作用,而一定浓度的黄连素可以抑制MDCK-chAbcb1细胞中P-gp对Rho123的跨膜转运,推测其可作为潜在的P-gp抑制剂进一步开发利用。为了进一步证实黄连素对肉鸡肠道P-gp的功能存在抑制作用,采用肉鸡回肠部位进行了Rho123的在体灌流实验。将6周龄AA肉鸡用不同剂量的黄连素(40和80mg/kg.bw)分别处理1天和3天后于回肠部位进行Rho123的在体灌流实验。结果表明40和80 mg/kg.bw的黄连素处理1天后,其吸收常数Ka分别为1.87和2.25 min-1,与对照组(1.12 min-1)相比显著升高(P<0.05 )。而表观渗透率(Papp)分别为0.0132和0.0076 cm·min-1,与对照组(0.0074 cm·min-1)相比差异不显著(P＞0.05 )。但是相应浓度黄连素连续灌服肉鸡3天后,其Ka和Papp(cm·min-1)与对照组比较均无显著性差异(P＞0.05)。结果提示一定剂量的黄连素短时间内给予肉鸡后对其回肠P-gp的外排确实有抑制作用,且该结果与体外实验结果一致,再次佐证黄连素对肉鸡回肠P-gp功能的抑制作用。最后本论文进行了体内外实验初步探讨了黄连素对P-gp表达影响是否与核受体CXR、CAR和PXR存在关联。实验首先采用不同浓度的黄连素分别处理MDCK-chAbcb1细胞和Caco-2细胞,然后采用realtimeRT-PCR方法检测了样品中Abcb1、PXR、CAR和CXRmRNA相对表达量。测定结果显示5 pM黄连素处理Caco-2细胞1-12h内,未对Abcb1 mRNA产生显著影响(P＞0.05 ),但处理24 h后发现其表达量显著上升(P<0.05);而该浓度的黄连素处理MDCK-chAbcb1细胞4-24 h时Abcb1 mRNA表达受到持续抑制。当黄连素浓度增加至20 μM时,其对Caco-2细胞中Abcb1 mRNA表达也表现出抑制作用,尤其在1-8 h内表现出显著抑制(P<0.05 ),但在12 h后其表达量开始恢复;而该浓度黄连素作用4 h后对MDCK-chAbcb1 mRNA表达表现为显著的抑制作用(P<0.05);当黄连素剂量再继续增加至40μM时,作用细胞1h即开始显著抑制(P<0.05)Abcb1的mRNA表达。采用免疫荧光方法检测相应浓度黄连素分别处理两种细胞后P-gp表达水平的变化,表现出与mRNA变化相似的结果。进一步探讨黄连素对Caco-2细胞中基因转录调控相关的核内受体mRNA表达水平的变化,发现该细胞中CAR mRNA表达变化与Abcb1 mRNA的表达变化趋势相似,呈现出一定的相关性。最后肉鸡体内实验结果表明,一定剂量的黄连素(40, 80 mg/kg)处理肉鸡1天时对肉鸡回肠中Abcb1和CXR mRNA表达水平有显著的抑制作用(P<0.05),呈现出较好的相关性,并且与体外实验结果相一致;但高剂量黄连素(80 mg/kg)连续处理肉鸡3天时对肉鸡Abcb1和CXR mRNA表达水平影响却不显著(P＞0.05 )。上述实验结果提示黄连素对哺乳动物肠道细胞和肉鸡小肠Abcb1的表达能产生一定的抑制作用,但该作用强度在不同细胞存在差异,且与用药浓度和给药时机存在一定关系,并推测黄连素对Abcb1的抑制作用可能受核内受体CAR (Caco-2细胞)和CXR (肉鸡)调控,具体的调控机制有待进一步深入研究。综上结果,我们成功地构建了功能性高表达鸡源P-gp的MDCK-chAbcb1细胞,可用于评价药物间相互作用及筛选P-gp抑制剂,同时证明黄连素对鸡源P-gp的表达和功能存在抑制作用;并推测黄连素的抑制作用可能受核内受体CAR (Caco-2细胞)和CXR (鸡)调控,但具体的调控机制有待进一步深入研究。本研究结果丰富了鸡P-gp蛋白研究领域的基础理论和数据库,并为研究兽药间相互作用提供了技术平台。