金黄色葡萄球菌是一类重要的人畜共患病原菌,能引起多种感染性疾病。作为一类机会致病菌,金黄色葡萄球菌通常定植于皮肤或黏膜表面,然而一旦有创伤形成,细菌便可入侵多种类型的表皮细胞,造成胞内的持续性感染。而且由于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)等耐药菌株的出现,进一步增加了防控感染的难度。关于耐药细菌胞内感染的治疗,目前仍是国内外学术界研究的热点和难点科学问题。因此,深入了解金黄色葡萄球菌入侵角质细胞及胞内的存活机制,寻求高效对抗细菌胞内感染的新型抗菌策略,对防控耐药性金黄色葡萄球菌的胞内感染具有重要的公共卫生学意义。为了研究金黄色葡萄球菌对角质细胞的侵染和存活能力,构建了金黄色葡萄球菌与角质细胞的互作模型。研究发现,人源和牛源的MRSA菌株对角质细胞均具有显著的黏附及侵袭能力。共聚焦显微镜观察和细菌胞内存活实验发现,MRSA菌株能够侵袭并存活于角质细胞,感染后24h存活率超过60%。细胞因子检测结果显示,胞内感染的MRSA菌株能够刺激角质细胞表达高水平的促炎性细胞因子及抗菌肽,结果表明,存活于角质细胞内的MRSA菌株在刺激角质细胞分泌高水平的细胞因子的同时又能抵御这些细胞因子对细菌的清除。为了阐明MRSA的胞内存活机制,基于iTRAQ比较蛋白组学技术,通过对MRSA菌株侵入角质细胞前后的全蛋白组比较分析,发现197个蛋白表达呈显著差异。对差异蛋白进行生物信息学(蛋白质功能注释、GO、KEGG以及STRING Pathway富集)分析,发现这些差异蛋白主要参与金黄色葡萄球菌细胞壁合成、碳水化合物的代谢以及对真核细胞侵染过程等。经iTRAQ数据分析发现,金黄色葡萄球菌的核糖激酶(RbsK)在细菌侵入角质细胞后,表达水平上调30倍,为所有获取的差异蛋白上调倍数最高。此外,生物信息学分析发现,胞内金黄色葡萄球菌的RbsK蛋白参与的细菌戊糖代谢及细胞壁壁磷壁酸(WTA)合成的通路均呈显著富集。表明RbsK蛋白可能有助于金黄色葡萄球菌的胞内感染。为进一步探究RbsK在MRSA胞内感染过程中发挥的功能,构建了金黄色葡萄球菌rbsK及相关基因的敲除突变菌株。研究发现,缺失rbsK基因能够导致MRSA菌株在以戊糖(D-核糖)为主要碳源的培养基中生长能力的显著下降,同时细菌在角质细胞内存活能力显著降低,表明RbsK可能介导细菌对角质细胞内戊糖的代谢,为细菌胞内的代谢和增殖提供所需的能量,从而有助于细菌在细胞内持续的存活。另外,金黄色葡萄球菌RbsK蛋白能够催化核糖生成核糖-5-P,而核糖-5-P通过细菌的蛋白酶TarI(3-磷酸甘油胞苷酰基转移酶)和TarJ(磷酸脱氢酶)介导的酶促反应生成WTA的关键元件——核糖醇。而敲除rbsK、tarI和tarJ基因均能够导致细菌对角质细胞黏附能力的显著下降,表明WTA核糖醇可能在金黄色葡萄球菌识别及黏附角质细胞过程中发挥重要作用。为了探索对抗MRSA胞内感染的新策略,选用金黄色葡萄球菌噬菌体及其编码的裂解酶(lysin)进行胞内杀菌研究。噬菌体是一类能够感染并裂解细菌的病毒,但噬菌体不易进入真核细胞,不能裂解胞内感染的细菌。为了将噬菌体引入细胞,清除胞内感染的MRSA,本研究筛选并获得一株低致病性的葡萄球菌SH-5作为运送载体,通过PLB策略(Phage-loaded bacteria,PLB)将金黄色葡萄球菌噬菌体SLPW导入细胞。研究发现,SLPW在体外能够高效感染并杀死MRSA菌株。而承载菌株SH-5能够在体外高效吸附SLPW,同时能以内化方式进入角质细胞。当PLB加入到MRSA感染的角质细胞后,胞内的MRSA数量显著下降,同时角质细胞的毒性和促炎性因子的表达水平逐渐降低。实验结果表明,PLB能有效清除角质细胞内感染的MRSA,并促使细胞状态逐渐恢复。噬菌体发挥裂菌功能依赖于其编码的裂解酶,裂解酶是噬菌体感染后期合成的一类细菌细胞壁水解酶,通常情况下,裂解酶比噬菌体具有更加高效和相对广谱的杀菌效果,为了探究裂解酶的胞内杀菌能力,利用大肠杆菌原核表达系统,构建了细胞穿膜肽(Cell-penetrating peptide,CPP)与葡萄球菌噬菌体裂解酶(JDlys)嵌合的重组蛋白(CPP-JDlys)。CPP通常是一组富含阳离子的短肽,可以成功运送功能蛋白进入真核细胞内部。研究发现,CPP-JDlys能够在体外高效裂解多种葡萄球菌。胞内杀菌实验和共聚焦显微镜结果显示,CPP-JDlys能够有效进入角质细胞,裂解细胞内的MRSA。CPP-JDlys的胞内杀菌能力显著强于溶葡萄球菌素和万古霉素。此外CPP-JDlys处理后细胞乳酸脱氢酶表达水平、促炎性细胞因子转录水平以及细胞凋亡数量均显著下降。表明CPP-JDlys在有效杀死角质细胞内MRSA的同时,能有效缓解MRSA诱导的细胞损伤及炎性反应。噬菌体及裂解酶均能有效的清除细胞内的MRSA菌株,二者能否有效治疗MRSA引起的动物感染?为了揭示这一问题,首先建立了MRSA感染小鼠的菌血症模型。以致死剂量的MRSA感染小鼠,经噬菌体治疗后菌血症小鼠的存活率达到80%;以非致死剂量的MRSA感染小鼠,噬菌体治疗后小鼠脏器中的细菌载量和促炎性细胞因子表达水平显著下降。结果表明噬菌体能有效治疗金黄色葡萄球菌引起的小鼠系统性感染。此外,嵌合裂解酶CPP-JDlys不但可以有效治疗小鼠的菌血症(治疗后存活率达到70%),而且能够缓解MRSA引起的小鼠皮肤损伤。研究发现,与未治疗组小鼠相比,CPP-JDlys治疗后小鼠脓肿组织内的细菌数下降超过10~4倍,脓肿面积明显减小,同时促炎性细胞因子的表达水平显著下降。进一步,为了研究噬菌体及裂解酶对奶牛乳房炎的治疗效果,采用了噬菌体-抗生素和裂解酶-抗生素混合疗法对乳房炎奶牛进行乳房灌注治疗,研究发现二者均能有效降低乳房炎奶牛乳汁中的金黄色葡萄球菌数量、体细胞数以及血液中促炎性细胞因子的表达水平,表明噬菌体及裂解酶均能有效控制奶牛乳房炎,同时改善乳汁品质。综上所述,本研究首先确认MRSA菌株能够高效侵染并存活于角质细胞内。通过比较蛋白组学研究,证明了RbsK及WTA在金黄色葡萄球菌对角质细胞的侵染及定植过程中发挥重要作用。进一步,基于噬菌体及裂解酶强大的体外杀菌效果,设计并构建了PLB和CPP-JDlys,证明了二者能够有效的清除细胞内的MRSA菌株。同时,体内研究表明噬菌体和裂解酶能够有效治疗MRSA引起的小鼠局部及系统性感染,并能对MRSA引起的奶牛乳房炎起到良好的防控效果。以上研究有助于进一步揭示MRSA菌株的胞内存活机制,同时为MRSA胞内感染的治疗提供新思路。