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斑马鱼因其个体小、易于饲养、性成熟周期短、体外受精和发育、易繁殖且繁殖率高、胚体透明容易观察、便于胚胎操作等优势,现已广泛地应用于基因功能相关研究。近年来在基因功能研究和疾病的基因治疗方面,基因组定点突变逐渐成为反向遗传学的研究热点,具有广阔的应用前景。在小鼠中通过同源重组进行基因敲除研究基因功能的技术已经相当成熟了,但是在其它低等脊椎动物和无脊椎动物中,还没有成熟的基因敲除技术。目前可以应用于斑马鱼的反向遗传学技术很有限,主要有TILLING技术、RNAi技术和Morpholinos技术。但是这些技术都不能获得斑马鱼目的基因敲除突变体,因而限制了斑马鱼反向遗传学的研究。锌指核酸酶(zinc finger nuclease, ZFN)包括两个部分,即锌指蛋白(zinc finger protein, ZFP)结构域和FokⅠ结构域,其中ZFP负责与特异性的核酸序列结合,而切割结构域Fok 1对DNA进行切割,形成DNA序列双链断裂。ZFN可使生物体通过非同源末端连接在断裂处产生突变,有望成为斑马鱼等生物基因敲除的得力工具。本课题主要以斑马鱼为模式生物,以小眼相关转录因子小眼相关转录因子a(microphthalmia-associate transcription factor a, mitfa)基因为靶位点,构建操作简便切实可行的目的基因敲除实验体系。首先,选择斑马鱼mitfa基因DNA序列的第2965bp～2988bp为靶位点,并设计一对特异性识别靶位点DNA序列的锌指蛋白。第二步,利用DNAWorks针对每一个ZFP设计出14条序列,通过两步法PCR合成ZFPs的编码序列276bp。第三步,将ZFPs的编码序列与切割结构域FokⅠ连接到表达载体PET-30a构成带组氨酸标签的ZFNs。第四步,利用Escherichia coli在22℃,0.3mM IPTG诱导下表达可溶性ZFNs,通过组氨酸亲和柱纯化ZFNs并利用SDS-PAGE进行检测。第五步,在25℃下,体外检测到ZFNs具有切割靶位点DNA的能力。最后,将ZFNs导入斑马鱼体内,获得了一条携带mitfa突变基因的斑马鱼,突变发生在斑马鱼mitfa基因第2977bp～2979bp。在整个实验体系中,我们首次引入DNAWorks和两步法PCR,极大地简化了ZFPs的DNA序列合成步骤；在体外表达ZFNs时,通过培养基优化获得了更多的可溶性ZFNs,简化了ZFNs的纯化过程；在斑马鱼体内进行目的基因敲除过程中,采用CMV启动子,增强了ZFNs表达的广泛性。通过系统研究,初步建立了一套简便的利用ZFNs敲除斑马鱼目的基因的实验体系,同时提出了一套更好的运用锌指核酸酶敲除靶基因的优化策略。该实验体系可以成功的应用于斑马鱼和其它物种中,为基因功能研究和人类疾病模型建立奠定基础。