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目的:乳腺癌是中国女性发病率最高的恶性肿瘤。乳腺癌干细胞(breast cancer stem cells,BCSCs)是乳腺癌细胞中存在比例很少但有很强自我更新能力和多向分化潜能的肿瘤细胞群,被认为是乳腺癌发生发展、复发转移和耐药的根源。由于介导BCSCs生物学特性的相关机制尚不明确,靶向BCSCs的研究具有重要的理论意义和临床价值。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)参与染色质修饰、X染色体失活、转录、翻译、基因印记、蛋白质的活性调控及RNA可变剪切调控等过程,与肿瘤发生发展密切相关,是肿瘤研究领域的热点。LncRNA调控BCSCs的生物学特性也备受关注。竞争性内源性RNA(Competing endogenous RNA,ceRNA)假说是一种全新的基因表达调控模式。以往研究从生物信息学、细胞生物学和动物模型等不同水平证实了ceRNA的调控机制,即具有相同miRNA应答元件(micro-RNA response elements,MREs)的lncRNA、mRNA、假基因转录物等通过竞争性结合同种miRNA调控彼此的表达水平及功能活性。近年来,文献相继报道了lncRNA通过竞争性结合miRNA,发挥类似miRNA Sponge机制,拮抗miRNA抑制靶基因的功能,进而影响肿瘤的发生发展,展现出基因转录后调控的新层次,也为理解肿瘤特性和干细胞特性提供了新思路。本研究通过LncRNAs基因芯片分析发现lncRNA LUCAT1(lung cancer associated transcript 1)在BCSCs中有明显高表达。LUCAT1位于5q14.3,首先在吸烟者的呼吸道上皮细胞中发现。LUCAT1在非小细胞肺癌组织中的表达明显高于正常组织,其高表达与TNM分期高、淋巴结转移阳性、预后差有关。目前尚未见LUCAT1在乳腺癌中的表达及其对BCSCs特性调控作用的相关报道。本项目通过分析LUCAT1在乳腺癌组织中的表达情况及其与临床病理因素和预后的相关性,同时旨在阐明LUCAT1调控BCSCs特性的分子机制,有望发现乳腺癌发生发展的新基因表达调控网络,为找到乳腺癌新的诊断标志物和特异性治疗靶点提供理论依据。研究方法:1.乳腺癌干细胞的诱导及干性鉴定:用无血清培养基悬浮条件将乳腺癌细胞MCF-7和T47D诱导成乳腺癌干细胞MCF-7 CSCs和T47D CSCs。通过形态学观察,qRT-PCR,Western blot和流式细胞术鉴定乳腺癌干细胞。2.基于基因组学和生物信息学的指标筛选:通过对lncRNAs基因芯片表达谱进行聚类分析,筛选出MCF-7 CSCs和MCF-7中显著差异表达的lncRNA LUCAT1。提取TCGA中的RNA-Seq数据,分析LUCAT1在CD44~+CD24~-及非CD44~+CD24~-乳腺癌患者中的差异表达及其与干性指标的相关性。3.乳腺癌组织样本中LUCAT1的表达及临床意义分析:在26对新鲜组织样本中,采用qRT-PCR检测LUCAT1在乳腺癌及癌旁组织的表达情况,分析其与干性指标SOX2表达的相关性。在151例乳腺癌组织中检测LUCAT1(免疫原位杂交),SOX2和TCF7L2(免疫组化)表达,应用皮尔逊卡方检验、Fisher精确检验、单因素及多因素logistic回归分析LUCAT1与临床病例因素的相关性,应用Kaplan-Meier生存分析评估LUCAT1表达与乳腺癌患者预后的相关性。4.细胞学实验:质粒转染构建LUCAT1不同表达的细胞模型;转染mimic或inhibitor构建miR-5582-3p不同表达的细胞模型。通过平板克隆实验和球囊形成实验分别检测乳腺癌细胞的增殖能力和乳腺癌干细胞的自我更新能力;通过qRT-PCR和Western blot检测OCT4、Nanog、SOX2等干性标记物及Wnt通路中TCF7L2和Wnt1的mRNA和蛋白水平的表达;通过流式细胞术检测细胞表面干性标记物CD24和CD44的表达;通过TOP/FOP-Flash双荧光素酶检测细胞内β-catenin介导的转录活性。5.基于生物信息学的靶基因预测及分子机制实验:通过mirDB,RNA hybrid,DIANA及Targetscan等数据库预测靶基因;双荧光素酶报告基因实验验证miR-5582-3p和LUCAT1存在特异性结合序列;RNA pull down实验进一步验证LUCAT1通过特异性序列与miR-5582-3p直接结合。6.体内实验:采用荷瘤鼠实验在体验证LUCAT1/miR-5582-3p/TCF7L2轴和Wnt/β-catenin信号通路对乳腺癌干性的调控机制。结果:1.乳腺癌干细胞的诱导及干性鉴定:MCF-7和T47D经诱导培养后,形态发生明显变化,成球囊样生长,有典型的乳腺癌干细胞特性:与亲本细胞相比,MCF-7 CSCs和T47D CSCs中CD44~+CD24~-细胞群的比例提高(p<0.01);干细胞标记物OCT4,Nanog和SOX2的mRNA和蛋白水平表达提高(p<0.05)。2.LncRNAs基因芯片提示:与MCF-7相比,LUCAT1在MCF-7 CSCs中明显高表达;乳腺癌组织中也检测到LUCAT1高表达,且与干性标志物SOX2的表达正相关(r=0.6701,p<0.001);TCGA分析提示LUCAT1在CD44~+CD24~-患者中的表达高于非CD44~+CD24~-患者(p=0.0274),且LUCAT1与干性(通路)相关指标OCT4、ABCC1、Wnt1、Notch1和HIF-1α的表达呈正相关(p<0.05)。3.LUCAT1在乳腺癌组织中的表达与肿瘤大小(p=0.015)、淋巴结转移(p=0.002)、TNM分期(p<0.001)相关。其中TNM分期是LUCAT1表达的独立影响因素(p<0.01)。LUCAT1表达较高的患者总生存期和无病生存期较短(p=0.006;p=0.011)。4.LUCAT1对BCCs干细胞样特性和BCSCs特性的调控:在MCF-7 CSCs和T47D CSCs中沉默LUCAT1后,OCT4、Nanog和SOX2的mRNA和蛋白水平表达降低(p<0.05),CD44~+CD24~-细胞群的比例减少(p<0.01),干细胞自我更新能力降低(p<0.01);在MCF-7和T47D中过表达LUCAT1后,OCT4、Nanog和SOX2的mRNA和蛋白水平表达提高(p<0.05),CD44~+CD24~-细胞比例增高(p<0.05),乳腺癌细胞增殖及集落形成能力增强(p<0.05)。5.LUCAT1与TCF7L2竞争性结合miR-5582-3p调控Wnt/β-catenin信号通路:mirDB及RNAhybrid数据库预测miR-5582-3p与LUCAT1结合;荧光素酶报告实验提示:过表达miR-5582-3p后,LUCAT1和miR-5582-3p结合位点野生型质粒转染的细胞的荧光素酶相对活性被明显抑制,但对突变型质粒转染的细胞抑制作用不明显(p<0.01);RNA pull-down实验提示:与NC探针相比,LUCAT1野生型探针与miRNAs共孵育结合的miR-5582-3p显著增多,而LUCAT1突变型探针结合的miR-5582-3p数量得到恢复。RNAhybrid,DIANA和Targetscan数据库均预测miR-5582-3p与TCF7L2结合;荧光素酶报告实验提示:与TCF7L2和miR-5582-3p结合位点突变型质粒转染的细胞相比,过表达miR-5582-3p明显抑制结合位点野生型质粒转染细胞的荧光素酶相对活性(p<0.01)。在MCF-7中上调LUCAT1的表达,可以逆转miR-5582-3p mimic引起的TOP/FOP转录活性的下降(p<0.05),同时可以显著升高TCF7L2、Wnt1、SOX2以及细胞核中β-catenin蛋白的表达(p<0.05)。在MCF-7 CSCs下调LUCAT1的表达可产生相反的结果(p<0.05)。6.动物实验验证LUCAT1/miR-5582-3p/TCF7L2轴和Wnt/β-catenin信号通路对乳腺癌干性的调控机制:在裸鼠模型中,过表达LUCAT1可促进肿瘤体积和瘤重的增加,这种影响可以被miR-5582-3p抑制(p<0.05);过表达miR-5582-3p可造成肿瘤体积和瘤重的减少,而过表达LUCAT1可以减弱这种影响(p<0.05)。与体外结果相同,在MCF-7中上调LUCAT1的表达可以缓解由miR-5582-3p agomir造成的TCF7L2、Wnt1、SOX2以及细胞核中β-catenin蛋白的表达降低(p<0.05)。同时,我们研究了LUCAT1在体内对BCSCs形成肿瘤的影响,在MCF-7 CSCs下调LUCAT1表达,使miR-5582-3p的表达增加,TCF7L2和Wnt通路相关蛋白的表达下降(p<0.05)。结论:1.乳腺癌中LUCAT1表达高提示预后不良。LUCAT1可能是评价乳腺癌预后的生物标志物。2.LUCAT1具有调控乳腺癌干细胞特性的生物学功能。3.LUCAT1作为ceRNA,与TCF7L2竞争性结合miR-5582-3p,激活Wnt/β-catenin信号通路进而调控乳腺癌干细胞特性。LUCAT1/miR-5582-3p/TCF7L2轴为深入研究BCSCs特性调控机制提供新思路和新靶点。