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嗜甲醇巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris,P.pastoris）是使用最为广泛的真核表达系统之一。其高效的醇氧化酶1启动子(Promoter of alcohol oxidase 1,PAOX1)可被甲醇强烈诱导但同时也被甘油等碳源强烈抑制,而甲醇作为一种化工原料,其大规模应用具有易燃易爆、碳源利用率低等缺陷。与甲醇相比,甘油等碳源具有易于代谢,还原力强等明显优势,因此构建甘油去阻遏型P.pastoris表达系统具有很高的应用价值,但需要从分子层面理解甘油抑制PAOX1机制。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae,S.cerevisiae）中,HOT1是MAPK/HOG信号通路中重要的转录因子,直接参与对多种甘油相关基因的调控,因此推测其在毕赤酵母中参与调控甲醇代谢。然而毕赤酵母MAPK/HOG信号通路的调控机制尚不清楚,HOT蛋白在MAPK/HOG信号通路及甲醇代谢中的调控机理需要深入研究。基于此,本文鉴定了P.pastoris中高渗诱导转录因子HOT1和HOT2,并对其发挥作用的分子机制以及对甲醇代谢的调控进行了研究,有以下研究成果:（1）首先鉴定了P.pastoris中HOT蛋白。以P.pastoris数据库为基础,寻找到了两个与S.cerevisiae HOT1序列同源性较高的序列,并命名为HOT1和HOT2;实验证明,HOT1和HOT2缺失都会降低细胞在高渗下的生长能力,它们在P.pastoris MAPK/HOG信号通路中起到重要作用。（2）检测了上游转录因子HOG1对HOT1、HOT2的调控。qPCR实验表明,P.pastoris中HOG1参与对HOT1基因转录水平的调控,同时酵母双杂实验结果表明HOG1与HOT1可在蛋白水平发生相互作用;而HOT2无论在转录水平还是蛋白水平均不受HOG1的调控。（3）HOT1和HOT2均定位于细胞核。推测HOT1和HOT2可能是通过改变其亚细胞定位从而发挥调控作用,因此将HOT1、HOT2与EGFP基因融合,通过细胞含有荧光的区域判断其不同条件下在细胞中的定位,结果表明:HOT1和HOT2在正常渗透压和高渗条件下均定位于细胞核中,同时HOG1基因的缺失不会改变HOT1和HOT2的亚细胞定位,HOT1和HOT2功能的发挥并不依赖于其在细胞内的定位。（4）之后研究了HOT1和HOT2对下游基因的调控。与S.cerevisiae不同,P.pastoris中GT1和GPD1的表达不受HOT1、HOT2的调控;将S.cerevisiae的PSTL1、PGPD1导入P.pastoris,发现HOT1、HOT2也不能诱导它们的表达,说明P.pastoris中HOT1和HOT2的功能已经发生变化。同时,HOT1不再参与对下游高渗响应基因DOG2、DAK1、HXT1、CTT1和HSP12基因转录水平的调控;HOT2参与对HXT1的调控,但不参与对其他上述基因的调控。（5）最后研究了HOT1和HOT2基因的缺失对甲醇代谢的影响。结果表明,HOT1和HOT2的缺失均可促进甲醇代谢,其中HOT2的缺失提高了菌株甘油中去阻遏的能力。