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目的本项目基于经络腧穴理论和现代康复理论,以电针联合跑台训练疗法与内质网应激关联性为切入点,以葡萄糖调节蛋白78(Glucose-regulated protein 78,GRP78)、生长停滞和DNA损伤诱导基因153(Growth arrest and DNAdamage-inducible gene153,GADD153)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12(cysteinyl aspartate specific proteinase,caspase-12为靶点,观察脑缺血早期施行电针联合跑台训练疗法对大鼠缺血病灶的修复和神经功能的改善作用,探讨电针联合跑台训练疗法影响内质网应激能力修复脑损伤的可能机制,为传统康复疗法与现代康复技术的临床结合运用提供新的实验依据和理论基础。方法选取120只SD(Sprague Dawley)大鼠(雄性,清洁级)按照随机分类的方法分为假手术组、模型组、针康组(即电针联合跑台训练组)、康复组(即跑台训练组)、电针组。假手术组不做任何干预,其余大鼠进行大脑中动脉脑缺血模型(Middle cerebral artery occlusion,MCAO),脑缺血造模成功后2h再灌注即为脑缺血再灌注模型。各组又分为脑缺血再灌注3、7、14d三个亚组。模型组、假手术组不予治疗;针康组、康复组于手术后4h开始给予电针治疗,穴位选取“百会”“风府”,参数为疏密波,5~100次/s,强度以大鼠肢体轻度抖动不嘶叫不挣扎为度(一般3~5V),时间20min,每日1次;针康组、康复组于手术后4h进行跑台训练,各亚组分别连续治疗3d、7d、14d。五组动物取材时间点分别为:干预3、7、14d。干预1、3、7、14d使用神经功能缺损评分(Neurological deficit score,NDS)观察各组大鼠神经功能缺损程度;于干预3、7、14d取材后行TTC染色,测量各组不同时间段大鼠的脑梗死体积;对各组大鼠干预3、7、14d缺血侧的海马进行Tunnel染色法,观察其组织细胞凋亡的情况;分别使用两种方法(western blot、RT-PCR)检测各组干预3、7、14d大鼠缺血侧海马的内质网应激反应细胞凋亡通路中GRP78、GADD153和caspase-12的蛋白与基因表达情况。结果1.神经功能缺损评分于造模后干预1、3、7、14d四个时间点对五组实验大鼠进行NDS,结果如下:假手术组术后四个时间点大鼠的NDS均为0分;模型组各个时间点的NDS均高于假手术组,有统计学意义(P<0.01);干预1d、3d和7d,三干预组NDS与模型组相比均有降低,但差异无统计学意义(P>0.05);干预14d,模型组NDS显著高于三干预组,有统计学意义(P<0.05或P<0.01);同针康组比较,其他两组干预组的NDS均高于针康组,组间差异有统计学意义(P<0.01)。2.梗死体积检测TTC染色后,大鼠缺血区呈现苍白色。缺血区与正常组织的界限清晰,能够区分正常区域与缺血区的界限,额、顶、颞叶以及基底节区可出现梗死。术后染色显示,假手术组无苍白色区域;模型组有明显的苍白区;干预3d,各干预组与模型组比较,各干预组苍白区的体积均较模型组大,但苍白区的体积差异无统计学意义(P>0.05);干预7d,除电针组外,两干预组与模型组比较,其苍白区的体积与模型组相比均较小,其差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。干预14d,三干预组与模型组比较,各干预组苍白区的体积均较后者大,且苍白区的体积差异有统计学意义(P<0.01);针康组苍白区的体积与其余两干预组相比均较小,且差异有统计学意义(P<0.01)。3.Tunnel法检测细胞凋亡Tunel染色法观察缺血后海马区3、7、14d细胞凋亡情况,可发现造模后3d各组细胞凋亡数量最多且凋亡率最高,3-14d之间细胞凋亡数量逐渐下降,凋亡率降低。干预3、7、14d,假手术组术后三个时间点大鼠的细胞凋亡率较为平稳;模型组各时间点细胞凋亡率与假手术组相比,均显著高于后者(P<0.01);模型组与三干预组相比,模型组细胞凋亡率均显著高于后者(P<0.01)。干预3d,针康组细胞凋亡率与电针组相比较低,组间差异有统计学意义(P<0.01)。干预14d,针康组细胞凋亡率与其他两干预组相比均较小,差异有统计学意义(P<0.05)。4.GRP78、GADD153和caspase-12蛋白的表达通过western blot技术发现,脑缺血再灌注后缺血侧海马区GRP78、GADD153和caspase-12表达均有所增强,假手术组可见GRP78、GADD153和caspase-12少量的表达,假手术组与模型组相比,所有蛋白表达均低于后者,差异有统计学意义(P<0.01)。干预3d,针康组GRP78表达强于其他两干预组和假手术组,有统计学意义(P<0.05)。模型组GADD153和caspase-12表达显著强于假手术组和其余三干预组,有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。针康组GADD153的表达于干预3d、14d与其余两干预组相比显著降低,差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。5.GRP78、GADD153和caspase-12基因的表达通过RT-PCR检测技术发现脑缺血后缺血侧海马RGRP78、GADD153和caspase-12表达均有所增强,假手术组可见GRP78、GADD153和caspase-12少量的表达,模型组较假手术组相比,三组基因表达各时间点均显著较假手术组高,且差异有统计学意义(P<0.01)。各时间点针康组GRP78表达均强于其他两干预组和模型组,组间比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。干预3、7d针康组与其他两干预组相比,针康组GADD153表达低于后者,其差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。干预7d针康组与其他两干预组相比,针康组caspase-12表达低于后者,其差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论1.电针与跑台训练两种疗法均能改善局灶性脑缺血后大鼠神经功能,同时减小脑梗死体积,减少细胞凋亡率,减轻局灶性脑缺血引起的内质网应激反应。2.同单纯电针或跑台训练疗法相比,二者联合治疗更能有效减少脑缺血再灌注大鼠脑梗死体积,减少细胞凋亡率,有效减轻局灶性脑缺血引起的内质网应激反应。3.电针联合跑台训练能够上调大鼠缺血区海马内质网应激反应GRP78的表达,同时下调内质网应激反应CHOP/GADD153和细胞凋亡因子Caspase-12。这可能是针康法减轻脑缺血再灌注后细胞凋亡,保护神经功能的相关机制之一。