显微注射法的高成本、低效率长期以来制约着转基因动物研究的发展,体细胞核移植技术的出现为转基因动物的制作提供了新的思路。转基因克隆技术使用预先筛选的基因修饰细胞作为核供体,可以大大提高转基因动物的制作效率,因此这一技术一经出现就受到广泛关注,成为研究热点。理论上所有的转基因克隆动物后代都是转基因动物,但事实并非如此,许多研究表明,利用该方法培育的克隆动物后代中转基因阳性率从0%到100%都存在。本研究试图通过转基因克隆的方法制作牛乳腺生物反应器,采用绿色荧光蛋白基因和新霉素抗性基因两个标记基因与人胰岛素原乳腺特异表达载体一起构建了可以在细胞和胚胎阶段进行双重筛选的转基因载体,并转染体外培养的牛胎儿成纤维细胞,经G418筛选后选择绿色荧光阳性细胞为核供体,制作克隆胚胎,进一步筛选绿色荧光阳性囊胚进行胚胎移植,通过三次筛选以避免非转基因胚胎用于移植,节约受体动物,提高转基因克隆的效率,最终得到了妊娠的结果。 1.转基因载体的构建: 将以牛α-乳白蛋白基因启动子指导人胰岛素原基因乳腺特异表达的载体p0.8-IS用酶HindⅢ和KpnⅠ切开后回收2.18kb的片段,连入pGEM-7zf(+)载体的MCS中,得到载体p7Z-IS;从载体pIRES2-EGFP上PCR得到Neo~r基因并在其两端引入NheⅠ和BamHⅠ两个酶切位点,将其插入pIRES2-EGFP的MCS中,