研究背景肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是世界上发病率较高的恶性肿瘤,严重威胁人们的健康和生命。全球不论在肝癌高发地区还是低发地区,HCC发病率男性高于女性2~8倍。在欧美,HCC的主要致病因素是慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染,而在亚洲和非洲则是慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染。目前HCC的治疗方法主要有外科治疗、消融技术、经动脉治疗、外电子束放疗、系统治疗以及系统治疗。由于手术治疗具有一定局限性,且辅助治疗的方法有限,因此,急需更有效的综合辅助治疗方法来提高患者预后,相对于传统的放化疗等辅助方法,分子靶向药物能有效地杀灭肿瘤细胞,疗效更好,且全身毒副作用较少,对HCC的治疗具有重要意义。沉默信息调节因子2相关酶1(silent information regμLator 2 homolog 1,SIRT1)与酵母中发现的沉默信息调节因子Sir2基因家族同源,sirtuin家族由7个成员(SIRT1-7)组成,它们共享高度保守的催化核心结构域并依赖于NAD+的酶功能,家族成员的N-和C-末端延伸及其亚细胞定位不同,它们共同负责其各种结合配偶体以及不同的代谢功能,介导刺激诱导的细胞凋亡。SIRT1能使组蛋白和其他关键转录调节因子脱乙酰化,如p53,NF-κB,Foxo,Ku70,E2F1,PPARγ共激活因子1α和缺氧诱导的转录因子(HIF)。它对基因转录的广泛影响已经集中在细胞衰老,新陈代谢,炎症和应激反应等有关的细胞活动中。研究显示,SIRT1在HCC患者中异常高表达。由此,本实验室基于SIRT1展开抗肝癌活性研究。研究目的利用计算机辅助药物设计,本实验应用Sybyl2.1平台的Surflex-Dock模块研究Tipranavir和SIRT1晶体的对接研究,通过体外抗肝癌活性研究,初步确定Tipranavir对肝癌细胞HepG2具有一定的抑制作用,但是具体通过哪些细胞通路来抑制肝癌细胞的增殖还有待研究,因此本课题从此出发,将研究Tipranavir的作用机制,为Tipranavir治疗HCC提供一些思路。研究内容1.应用Sybyl2.1进行分子对接,配体为Tipranavir受体为SIRT1蛋白。2.Tipranavir体外抗肝癌活性研究,例如通过MTT法检测药物对于肝癌细胞HepG2的增殖的影响、LDH法检测细胞增殖、流式细胞术检测药物对肝癌细胞凋亡的影响、Hoechst染色法检测细胞凋亡、蛋白免疫印迹法检测凋亡相关蛋白。3.构建HepG2细胞SIRT1沉默细胞株及验证及siRNA沉默SIRT1基因对HepG2细胞凋亡及凋亡相关蛋白的的影响。4.Tipranavir对HepG2细胞作用的时间和剂量对SIRT1蛋白表达的影响。5.SIRT1过表达对HepG2细胞凋亡的影响及作用机制探讨。研究结果本课题通过Tipranavir体外抗肝癌活性研究初步证实Tipranavir对肝癌细胞HepG2具有一定的增殖抑制作用,并通过流式细胞仪检测药物Tipranavir会促进细胞凋亡,通过siRNA-SIRT1沉默HepG2初步证实药物可通过抑制SIRT1从而促进细胞凋亡,并通过相关促凋亡蛋白验证得出Tipranavir通过抑制SIRT1促进细胞凋亡。