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目的:探索从LLC-P中分离能够在体外长期培养的CSCs的方法以及CSCs自我更新的调控机制。方法:在体外贴壁条件下培养LLC-P,通过连续富集悬浮生长的细胞,经过8代后,成功富集出可悬浮成球的LLC-SE。为了验证LLC-SE的干细胞特性,我们使用荧光定量PCR法检测表示干细胞特性的基因Bmi1、Cd133、Aldh1a1、Oct4、Sox2、Nanog和Klf4的表达。6孔板琼脂成球实验检测其增殖和悬浮成球能力。96孔板单细胞克隆形成实验检测单个细胞的克隆形成能力。裸鼠皮下移植这一干细胞特性验证的经典模型检测其干性和C57小鼠左肺原位种植模型验证其体内成瘤能力和转移能力。我们通过基因的差异表达和基因干扰的方法探究可能调控LLC-SE干性和自我更新的机制。通过对LLC-SE进行连续5代单克隆实验可进一步纯化出以对称分裂为主的LLC-SD和以非对称分裂为主的LLC-ASD肿瘤干细胞样细胞,并且通过BrdU标记验证LLC-SD和LLC-ASD确实存在对称分裂和非对称分裂。结果:RT-PCR结果显示,LLC-SE中Bmi1的表达水平显著高于LLC-P。6孔板琼脂成球实验、96孔板单细胞克隆形成实验表明LLC-SE的悬浮成球能力和单细胞克隆能力显著高于LLC-P。动物实验表明LLC-SE的体内致瘤能力、肿瘤转移能力强于LLC-P。RT-PCR显示Twist2在LLC-SE中的表达显著高于LLC-P。随后,我们对LLC-SE中的Twist2进行干扰,结果表明,Twist2被有效干扰后,LLC-SE琼脂成球能力和单细胞克隆形成能力下降,裸鼠皮下成瘤能力也发生变化。结论:首次运用连续8次悬浮聚球法分离获得大量的可稳定传代的具有干细胞特性的LLC-SE,为建立CSCs细胞模型提供了新的方法,为进一步研究CSCs的生物学特性奠定了基础。通过连续5代单克隆方法,纯化出具有与正常干细胞基本特性一致的,未/低分化的、可以进行对称分裂和非对称分裂的细胞模型,并初步探究了EMT转录调控因子Twist2对小鼠Lewis肺癌干细胞的干性的调控。