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研究背景及目的肝癌引起的死亡占全球肿瘤性死亡的第三位[1],且其发病率呈逐年上升的趋势。在我国肝癌的发病率仅次于肺癌和胃癌,死亡率在所有肿瘤中居前三位。目前手术切除是首选的治疗方式,但是肝癌的早期诊断率很低,大部分患者就诊时已处于晚期,伴有淋巴结或远处器官转移,失去了手术治疗的机会。肝癌细胞对化学治疗药物相对不敏感,化学治疗的总体生存率很低。目前肝癌的发病机制还没有完全了解,原癌基因的激活、肿瘤抑制基因的功能失常、细胞信号转导途径的异常活化都被认为参与肝癌的发生。因此探讨肝癌相关基因在肝癌发生中的作用和机制,有助于我们对肝癌发生机制的理解和认识,为肝癌的早期诊断和靶向治疗的研究提供新的理论依据。磷酸化蛋白50(Ezrin-radixin-moesin-binding phosphoprotein-50,EBP50)是一个55-kDa的磷酸化蛋白,属于PDZ骨架蛋白家族成员。EBP50含有2个PDZ结构域和一个ERM结构域,ERM结构域与ERM家族蛋白结合,调节细胞内信号转导途径[2]。EBP50是一个癌基因还是抑癌基因目前还存在争议,有研究报道EBP50在结肠癌、乳腺癌、前列腺癌中为抑癌基因,肿瘤中正常细胞顶膜的EBP50表达减少或消失,细胞质和细胞核中的EBP50表达增多[3-6]。Shibata等的研究发现,45%的肝癌患者EBP50mRNA表达增高,55%的患者表达水平无变化；与周围正常组织相比55%的患者细胞质和细胞核中的EBP50表达增高[7]。但是EBP50在肝癌发生中扮演的角色还不明确,究竟在肝癌中是一个癌基因还是抑癌基因?为了了解EBP50在肝癌发生中的作用及可能机制,本课题采用Western blot检测肝癌细胞系Hep3B,SMMC7721,HepG2中EBP50的表达水平,筛选出表达水平较低者SMMC7721细胞系,利用pBK-CMV-HA-EBP50质粒转染技术,构建EBP50急定高表达的SMMC7721细胞,通过细胞实验检测EBP50高表达后对肝癌细胞系SMMC7721生长增殖、凋亡、侵袭及转移能力的影响,并检测EBP50高表达前后SMMC7721细胞中β-catenin,E-cadherin蛋白表达水平的变化。构建裸鼠移皮下植瘤模型,通过体外实验检测EBP50高转染前后肿瘤的生长情况和对裸鼠的影响。利用Anti-EBP50siRNA下调SMMC7721细胞系中EBP50表达水平,检测EBP50表达下调后肝癌细胞系SMMC7721细胞的增殖、凋亡以及侵袭和转移能力的变化本实验旨在弄清EBP50在肝癌发生中的作用及可能机制,为肝癌的发生机制提供新的研究思路和可能的靶向治疗途径。方法1.运用Western blot技术检测肝癌细胞系Hep3B, SMMC7721, HepG2中EBP50蛋白表达,并比较EBP50蛋白在三种肝癌细胞系中的表达水平。2.选择EBP50蛋白表达水平较低的细胞系SMMC7721细胞,将pBK-CMV-HA-EBP50质粒和空载pBK-CMV-HA转染入SMMC7721细胞系中,将G418(350μg/mL)加入培养的转染细胞中,筛选稳定表达高水平EBP50的SMMC7721细胞系。运用RT-PCR技术检测转染效率,western blot检测转染前后SMMC7721细胞中EBP50、β-catenin,E-cadherin蛋白表达水平的变化,探寻EBP50在肝癌发生中可能的作用机制或通路。3.利用CCK-8法检测转染后12、24、48、72h细胞生长抑制率的变化；克隆形成实验观察EBP50高表达后SMMC7721细胞迁移增殖能力的变化,通过PI法染色流式细胞仪检测转染前后细胞周期的变化；通过Annexin V-FITC双染流式细胞仪检测EBP50转染前后细胞凋亡情况的变化；运用Transwell实验检测转染前后细胞体外侵袭能力的变化；将转染前后的细胞移植入裸鼠皮下,构造裸鼠皮下移植瘤的模型,检测EBP50转染前后细胞体内生长、增殖能力的变化以及对裸鼠体重影响等变化,TUNEL法检测体内细胞凋亡情况。4.利用Anti-EBP50SiRNA下调SMMC7721细胞系中EBP50表达水平,CCK-8检测EBP50表达下调后肝癌细胞系SMMC7721细胞的增殖能力变化,软琼脂糖克隆形成实验检测侵袭和转移能力的变化,Annexin V-FITC双染流式细胞仪检测EBP50下调前后细胞凋亡情况的变化。结果1. Western blot结果表明,EBP50在Hep3B, SMMC7721, HepG2三种肝癌细胞系中均有表达,但是SMMC7721细胞系中EBP50表达量最低,因此选用SMMC7721作为转染构建EBP50高表达的细胞系。Western blot技术检测表明,转染后SMMC7721细胞中EBP50表达明显增高,β-catenin蛋白表达水平明显下降(0.28±0.07vs0.56±0.12or0.58±0.08,P<0.05),E-cadherin蛋白表达水平明显升高(0.55±0.08vs0.39±0.07or0.40±0.06,P<0.05),提示EBP50可能与β-catenirn、E-cadherin相互作用而参与肝癌的发生。2.将pBK-CMV-HA-EBP50质粒通过LipofectamineTM2000转染入SMMC7721细胞系中后,RT-PCR验证与未转染及pBK-CMV-HA转染细胞相比,EBP50的表达明显增高(P<0.05)。在转染细胞中加入350μg/mL的G418共培养,对转染的细胞进行筛选,构建稳定高表达EBP50的SMMC7721细胞系。3.细胞实验表明,EBP50高表达后,SMMC7721细胞的迁移增殖能力明显减弱(P<0.05),细胞周期检测表明转染后细胞出现G0/G1细胞周期阻滞(61.3%±3.1%vs54.0%±2.4%or54.54±1.9%,P<0.05)。流式细胞仪检测表明转染EBP50的细胞凋亡率明显高于未转染细胞和转染空载细胞(14.8±2.7%vs3.4±1.3%or4.1±1.5%,P<0.05)。Transwell结果表明转染后细胞侵袭迁移能力明显减低(5.8±0.8vs21.6±1.3or20.4±1.1%,P<0.01)。裸鼠皮下移植瘤实验表明,EBP50高表达后,SMMC7721皮下成瘤能力明显减弱,瘤体的重量明显低于未转染组和空载组((28.9±7.2mg vs70.1±7.2mg or68.9±7.9mg),且体内细胞凋亡增多。4. EBP50表达下调后,SMMC7721细胞的迁移增殖能力明显增强(P<0.05),流式细胞仪检测表明转染EBP50的细胞凋亡率低于未转染细胞(4.7±1.36%、2.7±2.11%,P<0.05)。软琼脂糖克隆形成实验结果表明转染后细胞侵袭迁移能力明显减低(15±2.70和9士1.82,P<0.05)。结论EBP50高表达可以抑制肝癌细胞系SMMC7721的生长增殖、侵袭及转移能力,同时促进细胞凋亡。EBP50在肝癌的发生中起抑癌基因的作用,可能通过与β-catenin、E-cadherin相互作用而参与肝癌的发生。