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配体Semaphorin家族及其受体plexins蛋白最早被发现在神经轴突生长和信号转导中发挥重要作用。近年来,研究发现其在心脏形态发生和肿瘤的发生发展过程中也起着至关重要的作用。然而,其对肿瘤的调节机制还没有得到明确的认知。本研究发现,Semaphorin 6d(Sema6D)及其受体plexin-A1在胃癌血管内皮细胞中表达异常增高,并且与血管内皮生长因子受体2(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor2,VEGFR2)的表达水平呈现正相关性。提示Sema6D和plexin-A1可能与胃癌组织中的肿瘤血管生成密切相关。进一步结合对MGC803胃癌细胞的实验,利用质粒转染敲低plexin-A1信号后,发现VEGFR2在m RNA和蛋白水平的表达情况也随之变化。实验证实Sema6D可以识别并激活plexin-A1信号,plexin-A1进一步激活下游VEGFR2来调节影响肿瘤的血管生成。上述实验结果提示Sema6D/plexin-A1/VEGFR2可能是一个涉及肿瘤血管生成的信号通路。因此,利用药物靶向干扰该信号通路,进而影响胃癌肿瘤血管生成,有望为胃癌治疗提供一条新思路。目的:检测Sema6D及其受体plexin-A1在胃癌组织中的表达情况和两者对肿瘤血管生成的影响,并进一步探究其调节肿瘤血管生成的分子机制。方法:1.利用实时定量PCR(Real-time PCR)技术检测Sema6D及其受体plexin-A1在胃癌组织和癌旁正常胃粘膜组织中的mRNA表达情况。2.利用蛋白印迹(Western blot)技术检测Sema6D及其受体plexin-A1在胃癌组织和癌旁正常胃粘膜组织中的蛋白表达情况。3.利用反转录PCR(RT-PCR)技术检测三株胃癌细胞系和正常胃粘膜细胞系中plexin-A1、plexin-A2和plexin-A4的mRNA表达情况。4.利用免疫荧光(Immunofluorescence)技术检测Sema6D及其受体plexin-a1在胃癌组织和癌旁正常胃粘膜组织中的表达和定位情况。5.利用免疫荧光染色检测sema6d/plexin-a1分别和vegfr2在胃癌组织和癌旁正常胃粘膜中的共定位情况。6.用0、5、10μm浓度的异丙肾上腺素孵育胃癌细胞3个小时后,分别提取细胞的总rna和蛋白质;另外用5μm的异丙肾上腺素分别孵育胃癌细胞0、1、2、3、6小时后,收集细胞并提取总rna和蛋白质。7.利用质粒转染技术干扰mgc803胃癌细胞中plexin-a1的表达,检测其对下游vegfr2表达水平的影响。结果:1.实时定量pcr结果显示,胃癌组织中sema6d的mrna表达水平明显高于正常胃粘膜组织。蛋白印迹结果显示,sema6d蛋白表达水平在癌组织明显高于正常胃粘膜组织。2.在mgc803、hgc27和mnk45三株胃癌细胞系和ges-1正常胃粘膜细胞系中进行rt-pcr,检测几个sema6d的受体plexin-a1、plexin-a2和plexin-a4的mrna表达情况。结果显示,三株胃癌细胞系中plexin-a1表达水平比ges-1正常胃粘膜细胞系中明显增高,而plexin-a2和plexin-a4在胃癌和正常胃粘膜细胞系中的表达水平无显著差异。且在三株胃癌细胞系中plexin-a1的mrna表达水平均比plexin-a2和plexin-a4明显增高。3.实时定量pcr结果显示,胃癌组织中plexin-a1的mrna表达水平明显高于正常胃粘膜组织。蛋白印迹结果显示,plexin-a1蛋白表达水平在癌组织中也明显增高。4.免疫荧光结果显示,与正常胃粘膜组织比较,sema6d在胃癌组织的血管内皮细胞中高度表达。相似的结果指出,plexin-a1也主要在胃癌组织中的血管内皮细胞中高度表达。5.免疫荧光染色检测sema6d/plexin-a1分别与vegfr2在胃癌和癌旁正常胃粘膜组织的共同表达情况。结果显示,在胃癌组织中sema6d与vegfr2在血管内皮细胞中呈现明显的共定位现象,但在正常癌旁胃粘膜组中未发现上述现象。同样的,plexin-a1和vegfr2的双染现象在胃癌组织的血管内皮细胞中也十分明显。6.异丙肾上腺素作用于胃癌mgc-803和hgc-27细胞后,实时定量pcr结果显示,异丙肾上腺素可以刺激两株胃癌细胞系中plexin-a1的mRNA表达。蛋白印迹结果显示,异丙肾上腺素可以刺激两株胃癌细胞系中plexin-A1蛋白水平的增加。异丙肾上腺素作用于MGC-803胃癌细胞系,实时定量PCR和蛋白印迹结果一致的发现,plexin-A1的mRNA和蛋白水平的表达随着异丙肾上腺素作用的时间增加而增加。7.随着异丙肾上腺素处理MGC803和HGC27两株胃癌细胞系时间的增加,实时定量PCR和蛋白印迹结果发现其也可以促进胃癌细胞VEGFR2的mRNA和蛋白水平的表达。8.利用质粒转染技术干扰MGC803胃癌细胞中plexin-A1的表达后,发现VEGFR2在mRNA和蛋白水平的表达均明显降低。重要的是,实时定量PCR和蛋白印迹结果一致性地指出,成功干扰plexin-A1的表达后,异丙肾上腺素不能再促进VEGFR2在mRNA和蛋白水平的表达。结论:1.Sema6D及其受体plexin-A1在胃癌组织中高表达,且主要定位在血管内皮细胞中。2.Sema6D/plexin-A1可能通过调节VEGFR2信号进而影响肿瘤血管生成。3.异丙肾上腺素促进胃癌细胞plexin-A1和VEGFR2的表达,且需要依赖于plexin-A1的表达来促进VEGFR2的表达。