研究背景肺癌是最常见的肺原发性恶性肿瘤，绝大多数肺癌起源于支气管粘膜上皮。其死亡率自70年代至90年代上升幅度达111.85%，是所有恶性肿瘤中之最高，其中非小细胞肺癌占肺癌总数的80%，是最为常见的肺癌病理类型[1]。目前可供选择的治疗方法有限，导致肺癌死亡率高，平均5年生存率不到15%[2-4]。以肿瘤血管为靶点，开发具有抗血管生成作用的中药是一个十分活跃的研究领域。肿瘤血管生成过程中多种血管生成因子相互影响，寻找一种对肿瘤血管生成中多种血管生成因子具有靶向调节作用的药物是肿瘤抗血管生成治疗中亟待解决的关键问题之一。中医中药在抗肿瘤血管生成中有其独特的优势。蝎毒多肽提取物（polypeptide extract from scorpion venom，PESV）是本实验室从东亚钳蝎的蝎毒中提取并分离纯化的有效抗肿瘤成分，具有多种生物活性。当前实验研究已证明它可抑制人脐静脉内皮细胞的增殖并可抑制鸡胚尿囊膜新生血管的生成，但其抗肿瘤血管生成的机制尚未完全阐明。本研究通过体内外实验观察PESV对肿瘤血管生成中VEGF、HIF-1α和PTEN表达的影响，探讨其抑制肿瘤血管生成的作用机制。目的通过体外实验观察PESV对人肺癌A549细胞的细胞毒作用和对VEGF、HIF-1α和PTEN表达的影响，体内实验观察PESV对肺癌裸鼠移植瘤生长的影响及对VEGF、HIF-1α、PTEN基因和蛋白表达的影响,以揭示PESV抗肿瘤血管生成的作用机制，寻求中药抗肿瘤血管生成治疗非小细胞肺癌的新策略。方法1.采用噻唑蓝（MTT）法检测PESV对人A549细胞生长与增殖的影响，并根据吸光度值计算各药物浓度的细胞增殖抑制率。下游实验根据IC50值将对数生长期的A549细胞分为阴性对照组、PESV小剂量组、PESV中剂量组、PESV大剂量组，应用免疫细胞化学法、Western blot法检测PESV干预后VEGF、HIF-1α和PTEN蛋白表达的变化。2.构建裸鼠移植瘤模型，实验用裸鼠共18只，随机分为3组：荷瘤对照组、高剂量组和低剂量组。PESV隔日给药（灌胃法）一次，对照组给等体积的生理盐水。测量肿瘤体积并计算抑瘤率，绘制肿瘤体积生长曲线，观察PESV对肿瘤生长的抑制作用，实验共进行21天。3.通过RT-PCR法、Western blot法检测各处理组裸鼠移植瘤内血管生成调控因子VEGF、HIF-1α和PTEN的表达水平。结果1.PESV对人A549细胞生长与增殖的影响PESV浓度在25～200μg/mL时，对A549细胞增殖抑制作用明显，与阴性对照组相比，p均<0.01。25～200μg/mL剂量组之间两两比较差异显著，p均<0.01，总体呈剂量-效应关系，r=0.966，p<0.01。2.PESV对人A549细胞中VEGF、HIF-1α和PTEN表达的影响。免疫细胞化学法结果显示,PESV干预后A549细胞VEGF、HIF-1α的表达明显下调，各浓度组间比较（p<0.05或p<0.01）。PTEN的表达呈上升趋势，各组间比较（p<0.05或p<0.01）。Western blot法结果与免疫细胞化学法的结果基本一致。3.PESV对肺癌裸鼠移植瘤生长的影响PESV干预21天后，与荷瘤对照组相比，PESV高剂量组裸鼠肿瘤生长明显受到抑制，抑瘤率达40.36%（p<0.01）；PESV低剂量组抑瘤率为20.15%，差异亦有统计学意义（p<0.05）。4.PESV对肺癌裸鼠移植瘤中VEGF、HIF-1α和PTEN表达的影响RT-PCR法检测结果显示，PESV干预后肿瘤组织中VEGF和HIF-1α表达水平明显降低，各组间比较（p<0.05或p<0.01），PTEN的表达明显升高，各组间比较（p<0.05或p<0.01）。Western blot法结果与RT-PCR法的结果基本一致。结论1.PESV可抑制肺癌细胞及裸鼠移植瘤的生长2.PESV可影响肺癌细胞及组织中血管生成因子VEGF、HIF-1α和PTEN的表达，这可能是PESV抗肿瘤血管生成的机制之一。