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背景好发于成人中枢神经系统(Central nervous system,CNS)的各种原发性肿瘤中,胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GBM)发病率最高、恶性度最大,由于其呈高度侵袭性生长并对放疗、化疗不敏感,因此具有较高的复发率和致死率。尽管在过去的几十年中,GBM的诊疗手段取得了长足的进展,但是患者的预后仍不理想,平均生存期不到14个月。与其他恶性肿瘤相比,GBM通常在原位切除腔周围复发并仅限在CNS内生长,很少出现远处转移。因此目前的治疗方法主要针对肿瘤局部进行,溶瘤病毒就是其中的一种。1型单纯疱疹病毒、腺病毒、麻疹病毒等已被证实能选择性感染并破坏肿瘤细胞,但是临床试验的效果不容乐观,肿瘤体积的缩小或者患者生命周期的延长均未取得预期效果。于是寻找一种有效、安全的治疗新方法刻不容缓。我们在早期报道了一株人来源的博尔纳病病毒(Borna disease virus,BDV),感染少突胶质瘤(oligodendroglioma)细胞后,能够抑制细胞的增殖并促进凋亡。在神经母细胞瘤(neuroblastoma)细胞中,BDV也发挥了同样的抑制效应。提示BDV可能会干扰神经肿瘤细胞的恶性表型。此外,内源性博尔纳样核蛋白序列(endogenised bornavirus-derived element 1,EBLN1),能有效减少结肠癌细胞和宫颈癌细胞中内源性DNA损伤并及时修复外源性DNA损伤,从而起到稳定基因组的重要作用,这恰是抑制肿瘤的重要机制之一。提示EBLN1基因在肿瘤的形成中可能具有负调控作用。BDV是一种高度嗜神经性、非溶细胞性的负链RNA病毒,也是在远古时期整合到人类基因组的最古老病毒之一。基于BDV能感染健康人群并形成无症状的感染,以及前期报道BDV与EBLN1有潜在的抑制肿瘤效应,我们试图通过研究BDV这种与人类联系密切的病毒及其内源性片段EBLN1在胶质母细胞瘤中的双重抑瘤作用,去寻找一种与人类来源更近、毒副作用更小的治疗新手段。为进一步揭示肿瘤形成过程中环境因素与机体的交互作用提供新的研究途径。目的1、检测BDV对GBM细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭等生物特性的作用;观察BDV对裸鼠GBM移植瘤生长的影响,从而明确BDV在GBM中的抑瘤效果。2、完成GBM细胞感染BDV后转录组的测序,通过分析差异基因,筛选相关的信号通路并验证,探讨BDV抑瘤作用的分子机制。3、分析EBLN1基因在不同级别胶质瘤患者中的表达差异,验证EBLN1过表达对裸鼠GBM移植瘤生长的影响,深入认识EBLN1基因的功能。方法1、使用BDV感染两株GBM细胞(U87MG和U251)以及正常人胶质细胞(HA),通过CCK-8法、流式分析技术、划痕实验、Transwell实验等检测BDV在肿瘤细胞增殖、凋亡、周期、迁移和侵袭等生物学功能中的作用;利用U87MG细胞构建裸鼠皮下荷瘤模型和颅内荷瘤模型,观察BDV对GBM在体成瘤的影响。在GBM细胞和组织中,分别利用Western blotting(WB)技术和免疫组化技术检测肿瘤相关蛋白的表达情况。2、基于mRNA-Seq技术对GBM细胞的转录组进行分析比较,筛选出BDV感染引起的差异表达基因,同时使用GO富集分析,KEGG pathway富集分析等技术对差异基因进一步解读,寻找出BDV对GBM作用的主要信号通路,并结合Western blotting技术加以验证。3、从癌症基因组图谱(the cancer genome atlas,TCGA)数据库收集胶质瘤相关数据,下载EBLN1基因的表达谱和临床信息。分析EBLN1表达和临床病理学参数的相关性及对生存的影响。在GBM裸鼠皮下荷瘤模型中,观察EBLN1过表达对GBM成瘤的影响,同时也分析EBLN1和BDV在GBM形成中的相互作用。结果1、在体外实验中,BDV感染U87MG和U251细胞后,与对照组相比,呈剂量依赖性地减少肿瘤细胞的增殖能力,同时削弱细胞的迁移和侵袭活性并促进细胞凋亡。而在HA细胞中,BDV感染并未影响细胞的正常功能。在体内实验中,BDV能明显抑制裸鼠GBM移植瘤的生长:经瘤注射BDV后,皮下肿瘤体积缩小近63%,颅内肿瘤体积缩小近37.5%;同时未观察到BDV对动物的不良影响。在BDV感染的GBM细胞中,Bcl-2,MMP-2/9和VEGF蛋白表达明显水平下调,BAX蛋白表达水平上调;在经BDV处理的GBM组织中,Bcl-2,MMP-2、CD34、PCNA和VEGF蛋白表达水平显著下调,BAX蛋白表达水平上调。2、BDV感染U87MG细胞后,1827个基因发生显著变化,其中上调1250个,下调577个。这些差异基因影响了 GBM细胞中多种生物学进程的调控。BDV降低EGFR的表达水平,进而抑制其下游PI3K/AKT/mTOR和ERK1/2信号通路的活性,最终起到调节GBM细胞恶性表型的作用。3、在TCGA数据集中共纳入563例临床参数完整的胶质瘤病例资料,GBM病理组织样本中EBLN1的表达水平显著低于其他类型的胶质瘤并且与患者生存状态相关。在体内实验中,EBLN1过表达的裸鼠皮下移植瘤生长缓慢,与对照组相比,体积缩小近42.7%;如同时给予BDV瘤内注射后,肿瘤体积进一步缩小约32.9%。结论1、BDV有效抑制GBM细胞的恶性表型,并阻碍裸鼠体内GBM成瘤,而且对正常细胞和动物发育未见有不良影响。说明BDV可以成为GBM的治疗的候选。2、BDV感染引起GBM细胞转录组的显著变化,进而影响到肿瘤细胞多个生物学过程的功能。BDV通过降低EGFR/PI3K/AKT/mTOR和ERK1/2信号通路的活性发挥抑制GBM作用。3、在GBM患者中,EBLN1基因的表达水平普遍降低,并且与患者生存状态相关。EBLN1过表达能显著抑制裸鼠皮下GBM移植瘤的生长,而且能和BDV发挥协同抑瘤效应。