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虽然过去数十年来胰腺导管腺癌(Pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)的基础与临床研究取得了丰硕的成果,但是胰腺癌治疗仍是世界性的医学难题。胰腺癌对放化疗高度耐药是其预后不佳的主要原因之一。大量临床研究表明即使采用健择(Gemcitabine, GEM)单独以及与其它化疗药物联用的各种治疗方案也不大可能明显改善胰腺癌的预后,而且还往往伴随着更大的毒性。因此,新的治疗策略的探索就显得非常的必要,靶向性治疗与传统化疗的联合应用可能是有效且可行的解决方案。对于胰腺癌来说,开发出与GEM联合应用的靶向药物是目前研究的重点与热点。传统的胰腺癌研究模式将焦点集中于胰腺癌细胞本身,忽略了肿瘤微环境对胰腺癌细胞的影响,这可能是现阶段绝大多数针对胰腺癌细胞的靶向治疗策略效果欠佳的重要原因之一。肿瘤微环境是肿瘤周围复杂的细胞生态系统,与肿瘤细胞的生长、迁移、转移、和放化疗耐药性都有密切关系。胰腺星形细胞(pancreatic stellate cell, PSC)是胰腺癌微环境中的关键性细胞。正常胰腺组织内PSC呈静止状态,胰腺癌发生后PSC活化,变成胰腺癌相关星形细胞(pancreatic cancer associated pancreaticstellate cell,Pa-PSC)。PSC活化、增殖产生大量细胞外基质及可溶性因子,导致PDAC间质内大量纤维结缔组织增生(desmoplasia),后者是PDAC最具特征性的组织病理学改变之一。PSC与胰腺癌细胞间的相互作用是近年来PDAC研究的热点领域,开辟了胰腺癌细胞与分子生物学研究的新模式,为胰腺癌靶向治疗带来了曙光。在本研究中,我们进行活化PSC与静止PSC间的差异表达基因谱检测,筛选出在活化PSC中高表达的细胞因子SDF-1α(又称CXCL12)并通过传统检测手段验证SDF-1α在活化PSC中的表达,进而探讨PSC旁分泌因子SDF-1α对胰腺癌细胞GEM耐药的影响与机制,进一步阐明PSC与胰腺癌细胞间的相互作用机制,为针对肿瘤微环境的胰腺癌治疗策略提供潜在治疗靶点。本研究主要做了以下几个方面的研究：一、活化PSC与静止PSC间差异表达基因的筛选1.本研究采用outgrowth法从胰腺癌组织中原代培养活化PSC,并通过a-SMA、 Vimentin免疫荧光进行了验证。2.利用全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)处理活化状态的PSC,使其发生去活化。根据细胞形态及油红O、a-SMA染色进行验证。3.利用GeneChip(?)Human Transcriptome Array2.0芯片筛选活化及静止PSC中差异表达的基因。4.通过使用生物信息学数据库对差异基因进行了功能注释,及主要信号通路的分析。5.利用传统检测方法验证SDF-1α在活化PSC中的表达水平显著高于静止PSC。二、证实活化PSC对胰腺癌细胞化疗耐药性的影响由SDF-1α介导1.在4例原代培养的活化PSC及4种胰腺癌细胞系中,检测SDF-1α及其特异性受体CXCR4的表达水平,并选择CXCR4高表达SDF-1αt低表达的Pane-1细胞作后续研究中采用的细胞系。2.通过MTT试验,验证PSC条件培养基(PSC-conditioned medium, PSC-CM)可以降低GEM对Pane-1的细胞毒性。3.利用PSC-CM和SDF-1α中和抗体(SDF-la Ab)处理Pane-1细胞,通过Hoechst染色及流式Annexin V-FITC/PI法验证了SDF-1α介导了PSC对GEM诱导的Pane-1细胞凋亡的抑制作用。三、SDF-1a能够通过上调Pane-1细胞中IL-6的表达抑制GEM诱导的Pane-1细胞凋亡1.人重组蛋白SDF-1α可以上调Pane-1细胞中IL-6及IL-8的mRNA表达水平,IL-6表达水平的升高尤为显著,且SDF-1α中和抗体处理可以显著抑制SDF-1α诱导的Panc-1中IL-6mRNA及蛋白水平的升高。2. CXCR4特异性拮抗剂AMD3100处理可以抑制SDF-1α诱导的Pane-1细胞中IL-6mRNA及蛋白水平的升高。3.Hoechst染色观察细胞凋亡时细胞核形态的改变,结果显示,相对于GEM处理组及GEM+SDF-1α+IL6Ab组,GEM+SDF-1α组细胞凋亡比例显著减少。4.Annexin V-FITC/PI法检测细胞的早期与晚期凋亡。结果显示,GEM处理组及GEM+SDF-1α+IL6Ab组的早期凋亡细胞比例均显著增加,与GEM+SDF-1α组相比具有统计学差异。四、SDF-1α经由活化FAK/AKT以及ERK1/2信号通路上调Panc-1细胞中IL-6表达1.利用人重组SDF-1α蛋白处理Panc-1细胞,Western blot检测细胞内FAK、AKT以及ERK1/2的磷酸化水平,结果显示SDF-1α可以促进FAK, AKT以及ERK1/2的磷酸化水平。2.利用Western blot方法检测FAK特异性抑制剂PF573228处理对SDF-1α诱导的Pane-1细胞内FAK、KT、ERK1/2磷酸化水平的影响。结果显示PF573228可以减少SDF-1α诱导的FAK、AKT磷酸化,但不影响ERK1/2磷酸化水平。3.利用Real-timePCR及ELISA方法检测PD98059(ERK1/2特异性抑制剂)、PF57322(FAK特异性抑制剂)处理分别对SDF-1α诱导的Panc-1细胞IL-6表达的影响,结果显示,PD98059与PF573228均能抑制SDF-1α诱导的Panc-1细胞IL-6上调。总之,本研究显示,活化的PSC能够促进胰腺癌细胞发生GEM化疗耐药。其机制可能为：活化的PSC高表达SDF-1α,以旁分泌的方式作用于胰腺癌细胞,经由SDF-1α/CXCR4生物轴活化胰腺癌细胞内的FAK-AKT及ERK1/2信号通路,上调胰腺癌细胞中IL-6的表达水平,最终通过IL-6自分泌环介导胰腺癌细胞发生GEM耐药。我们的研究结果表明,PSC与胰腺癌细胞相互作用的研究可能成为胰腺癌化疗耐药研究新的突破点,能够更加贴切地模拟人体内胰腺癌的真实环境；SDF-1α/CXCR4生物轴及其活化的下游胰腺癌细胞内信号通路是重要潜在的胰腺癌治疗靶点,针对SDF-1α/CXCR4生物轴的靶向治疗策略与GEM协同作用可能改善胰腺癌的治疗效果。