背景 恶性实体肿瘤的生长和转移依赖于血管生成，肿瘤血管除向肿瘤细胞提供营养外，还不断地向人体其它部位输送肿瘤细胞，导致恶性肿瘤的转移。肿瘤转移是肿瘤治疗失败的主要原因，因此抑制肿瘤新生血管的形成，是肿瘤临床治疗中的一个值得研究的新方向。血管生成抑制剂的应用不仅使肿瘤得不到营养，诱发肿瘤凋亡，达到"饿死"肿瘤的目的，而且切断了肿瘤转移的途径，可有效抑制肿瘤转移，这是传统化疗药物无法达到的。已经证明恶性肿瘤的血管形成过程受血管形成因子和抑制因子的严密调控，目前已经发现30多种具有促血管形成作用的因子，其中最重要的包括血管内皮细胞生长因子 (VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和基质金属蛋白酶(MMP)等。大肠癌是最常见的恶性肿瘤之一, 对人类健康和生命造成很大威胁，在我国恶性肿瘤的死因中居第4至第6位。其治疗目前以手术和化疗为主，辅以生物治疗, 但这些方法存在各自局限性，其疗效仍不能令人满意。研究表明，大肠癌的发生、发展及转移与肿瘤血管生成密切相关，抗大肠癌血管生成的治疗将为提高大肠癌综合治疗效果开辟一条崭新有效途径。近年来有研究证明，多西紫杉醇在体外具有抗肿瘤血管生成的效应，并推测这与其抗肿瘤作用有关。目前国内外对多西紫杉醇抗肿瘤血管形成的研究还很少，对其确切机制尚未阐明。本课题以LS174T大肠癌细胞株和裸鼠皮下移植大肠癌模型为研究对象，从体内和体外两方面探讨多西紫杉醇抗大肠癌血管生成的作用和机制。体外实验研究目的 探讨多西紫杉醇体外抗血管生成的作用和机理，为整体水平多西紫杉醇抑制血管生成的研究奠定基础。方法1．通过四唑盐比色实验（MTT）检测多西紫杉醇对人脐静脉内皮细胞株（HUVEC）和LS174T细胞增殖的影响，并结合锥虫兰实验判断药物对两种细胞无细胞毒作用的最大浓度。实验分为空白对照组、溶剂对照组及0.05、0.1、0.2、0.5、1.0ng/mL多西紫杉醇共7个组。2．采用内皮细胞迁移和小管形成实验检测多西紫杉醇对HUVEC的迁移、小管形成的作用，分组方法同以上MTT实验。3．培养大鼠动脉环，研究多西紫杉醇对大鼠动脉环血管新生的作用，分组方法<WP=7>同以上MTT实验。4．用0.1、0.5、1.0ng/mL多西紫杉醇作用于LS174T细胞24h后，收集上清液，在含明胶的SDS-PAGE凝胶中进行电泳，测定该药对细胞明胶酶活性的影响。5．0.1、0.5、1.0ng/mL多西紫杉醇作用于LS174T细胞24h后，提取总蛋白。采用蛋白免疫印迹法（Western blot）研究多西紫杉醇对LS174T细胞表达VEGF、bFGF、MMP2和MMP9的作用。结果1. 实验各组MTT的平均吸光度值分别为0.307±0.07、0.305±0.08、0.301±0.05、0.298±0.06、0.251±0.04、0.224±0.05、0.205±0.02，前4组之间的两两比较均不存在显著差异（P>0.05），其余各组间两两比较均具有显著差异（P<0.01）。结合锥虫兰实验，最终判定在本实验条件下，0.2ng/mL和 1.0ng/mL为多西紫杉醇对HUVEC和LS174T细胞株无细胞毒作用的最大浓度。2. 多西紫杉醇作用于HUVEC细胞48h后，每高倍镜下发生迁移的细胞数量各自为44.36±4.8、42.28±5.2、 37.75±4.6、28.65±3.6、15.59±2.1、10.82±1.3、7.43±0.6；多西紫杉醇作用72h后，平均小管形成长度依次为192.36±11.54μm、188.89±7.59μm、175.53±11.54μm、166.78±12.35μm、151.62±16.38μm、118.65±11.58μm、78.93±3.67μm；2个实验的空白对照和溶剂对照组之间的比较均不存在显著差异（P>0.05），其余组间的两两比较均具有显著差异（P<0.01）。3. 大鼠动脉环第13d各组新生血管数目依次为101.00±10.8、97.88±7.8、73.00±6.6、60.88±5.8、52.25±5.3、33.13±2.8、18.13±1.3。空白对照和溶剂对照组之间的比较不存在显著差异（P>0.05），其余各组间两两比较均具有显著差异（P<0.01）。4. 与溶剂对照组相比较，0.1、0.5、1.0ng/mL多西紫杉醇组LS174T细胞的明胶酶活性呈逐渐下降趋势，且存在剂量依赖性关系，各组间两两比较均具有显著性差异（P<0.01）。5. 与溶剂对照组相比较，0.1、0.5、1.0ng/mL多西紫杉醇组LS174T细胞VEGF、bFGF、MMP2和MMP9的mRNA和蛋白表达呈明显减低趋势（P<0.01），基本呈现量效依赖关系。结论1．无细胞毒作用的多西紫杉醇具有不同程度的抑制HUVEC迁移、小管形成的作用。2．多西紫杉醇具有良好的抑制大鼠动脉环血管生成的作用。<WP=8>3．非细胞毒浓度的多西紫杉醇具有抑制LS174T细胞明胶酶活性和VEGF、bFGF、MMP2和MMP9 表达的作用关键词 多西紫杉醇;LS174T细胞;血管形成;bFGF;VEGF;MMP2;MMP9;内皮迁移;内皮小管形成;大鼠动脉环;蛋白免疫印迹;RT-PCR