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目的:鲍曼不动杆菌（baumannii,A.baumannii）是医院内主要的条件致病菌,免疫功能低下尤其是重症监护病房的患者容易感染。因多重和泛耐药A.baumannii的不断增多且感染后死亡率高达35%,A.baumannii感染的治疗是全世界面临的难题。外膜蛋白A（Outer membrane protein A,Omp A）是A.baumannii主要的毒力因子,可影响病菌生物膜的形成与成熟、对上皮细胞的侵袭与粘附且主要在早期发挥作用,因而探索Omp A的致病机制,是控制A.baumannii早期感染的一个关键因素。宿主先天免疫系统是抵抗细菌感染的第一道防线,探讨Omp A与先天免疫系统的关系可能为A.baumannii感染的治疗提供一种新的策略。方法:第一部分:鲍曼不动杆菌依赖外膜蛋白A增强NLRP3炎症小体的激活（1）利用同源重组法构建Omp A基因敲除/回补突变菌株,通过测序、聚合酶链式反应（PCR）及蛋白免疫印迹（Western blot）鉴定敲除/回补结果。（2）将肺泡上皮细胞按5×104个/ml细胞浓度接种于六孔板培养,直至融合达60-70%时,分为:正常对照组（正常肺泡上皮细胞培养并加入与培养基等量的0.9%生理盐水干预）;Omp A敲除菌株感染组（正常肺泡上皮细胞培养至60-70%融合时加入敲除Omp A的菌株干预,MOI=1）;Omp A回补与野生菌株（WT）感染组（正常肺泡上皮细胞培养至60-70%融合时分别加入回补Omp A的菌株和野生菌株干预,MOI=1）,3h后收集细胞蛋白及RNA样本。Western blot和实时荧光定量（q RT-PCR）检测NLRP3（NOD-Like receptor protein 3,NLRP3）炎症小体相关蛋白IL-1β、IL-18、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）、Caspase-1P10/P20及NLRP3、IL-1β、Caspase-1m RNA的表达。（3）自气管注射0.4ml（5×108CFU/ml,OD600约0.1）各型菌液以建立大鼠肺炎感染模型,HE染色等观察肺的病理改变评估模型构建是否成功;髓过氧化物酶（M PO）及肺组织湿/干比重评估肺急性炎性损伤;ELISA及免疫组织化学染色、West ern blot与q RT-PCR检测肺组织NLRP3炎症小体相关蛋白和基因的表达以评判O mp A突变对NLRP3炎症小体激活的影响;流式细胞仪检测CD11b/c-PE+Ly-6G-FI TC的双阳性表达评估中性粒细胞的募集能力变化。第二部分:敲低NLRP3-ASC-Caspase-1炎症小体轴相应蛋白的表达对鲍曼不动杆菌感染的影响正常肺泡上皮细胞按5×104个/ml的浓度接种于六孔板直至融合60-70%,以3μg质粒与9μl PEI/孔的比例分别转染阴性对照质粒（Negative）、NLRP3、ASC及C aspase-1敲低质粒（NLRP3/ASC/Caspase-1-sh RNA）,转染6-8h后更换2%FBS的低血清培养液继续培养至45h,将转染成功的实验细胞分为4组:（1）正常对照组（不做任何处理）,（2）细胞+敲低质粒+Omp A-/-A.baumannii感染组（敲除Omp A的A.baum annii菌株感染,MOI=1）,（3）细胞+敲低质粒+WT A.baumannii感染组（野生型A.b aumannii菌株感染,MOI=1）,（4）细胞+阴性对照质粒（Negative）+WT A.baumanni i感染组（野生型A.baumannii菌株感染,MOI=1）,持续感染3h收集细胞蛋白及RN A样本,Western blot及免疫组织化学法与q RT-PCR检测NLRP3炎症小体相关蛋白和基因的表达评判A.baumannii致病能力变化。第三部分:MG-132抑制蛋白酶体的泛素化降解对鲍曼不动杆菌感染的影响（1）正常肺泡上皮细胞按5×104个/ml细胞浓度接种于六孔板直至融合60-70%,将实验细胞随机分为3组:（1）正常对照组（不做任何处理）,（2）细胞+Omp A-/-A.baumannii感染组（敲除Omp A的A.baumannii菌株感染,MOI=1）,（3）细胞+Omp A-/-A.baumannii组（敲除Omp A的A.baumannii菌株感染,MOI=1）+MG-132（浓度10 m M）,持续感染3 h,探索蛋白酶抑制剂对敲除Omp A后A.baumannii感染的影响。（2）再将感染菌株更换为野生型菌液构建体外感染模型,分组同前,持续感染3h收集样本,Western blot、免疫组织化学和q RT-PCR检测NLRP3炎症小体相关蛋白和基因的表达,探索MG-132对野生型A.baumannii感染的影响,推断Om p A与Caspase-1的关系。（3）气管注射0.4ml（5×108CFU/ml,OD600大约0.1）敲除菌液构建大鼠体内肺炎感染模型,实验动物随机分为3组（1）正常对照组（气管慢慢注入0.4毫升0.9%的生理盐水构建对照组,n=10）;（2）Omp A-/-模型组（等量的敲除菌株菌液构建感染模型,每天以0.4毫升0.9%的生理盐水持续腹腔注射3天构建阳性对照组,n=10）;（3）Omp A-/-+MG-132模型组（等量的敲除菌株菌液构建感染模型,每天MG-132以0.1 mg/kg/d持续腹腔注射3天,n=10）,注意腹部保护;同样将感染菌株更换为野生型A.baumannii菌液构建感染模型。至模型构建完成后,按照贵州医科大学伦理委员会的要求处理动物。HE染色观察肺的病理改变;MPO及肺组织湿/干比重评判肺急性损伤的炎性程度;ELISA、免疫组织化学染色、Western blot和q RT-PCR检测肺组织NLRP3炎症小体相关蛋白和基因以及泛素相关蛋白K48/K63/PD41的表达以判定MG-132与NLRP3炎症小体激活的关系和Omp A的可能作用。结果:第一部分:鲍曼不动杆菌依赖外膜蛋白A增强NLRP3炎症小体的激活（1）成功构建Omp A突变菌株:测序、PCR及Western blot结果均显示同源重组法成功构建敲除/回补突变菌株。（2）体外感染模型证实A.baumannii感染后Omp A增强NLRP3炎症小体的激活:感染组NLRP3炎症小体相关蛋白IL-1β、IL-18、ASC、Caspase-1P10/P20的表达显著高于正常对照组（p<0.05）;与敲除组相比,回补与野生组NLRP3炎症小体相关蛋白的表达增高（p<0.05）,但回补与野生型两组相比差异无统计学意义（p>0.05）;NLRP3、IL-1β、Caspase-1的m RNA水平变化趋势与蛋白表达结果一致。（3）体内感染模型影响NLRP3炎症小体的激活趋势与体外一致:成功复制大鼠肺炎模型,感染组HE染色结果为进行性加重的重症弥漫性间质肺炎,其中回补组与野生型两组病理变化相似,两组病理损伤程度均比敲除组显著。所有感染组的MPO及肺组织湿/干比重的比值均显著高于正常对照组（p<0.05）,与敲除组相比,回补与野生两组比值增高的更明显（p<0.05）;流式细胞仪检测CD11b/c-PE+Ly-6G-FITC双阳性表达率为敲除组43.88%,明显低于野生型组的83.32%（p<0.05）,回补基因片段后阳性率提高到73.6%,提示敲除Omp A基因后中性粒细胞的募集能力减弱,回补基因片段后募集能力提高,均明显高于敲除组（p<0.05）;NLRP3炎症小体相关蛋白的表达及m RNA的表达和IL-1β、IL-18的水平均在回补与野生型两组表达最高,敲除组中表达降低（p<0.05）,所有感染组的表达均高于正常组（p<0.05）,但回补与野生型组之间差异无统计学意义（p>0.05）。第二部分:敲低NLRP3-ASC-Caspase-1炎症小体轴相应蛋白的表达对鲍曼不动杆菌感染的影响（1）特异性的敲低NLRP3与Caspase-1的表达后,敲低组内NLRP3炎症小体相关蛋白IL-1β、IL-18、ASC、Caspase-1P10/P20及m RNA的表达与阴性对照组相比均明显降低（p<0.05）,敲低组内敲除株感染组中NLRP3炎症小体相关蛋白及m RNA的表达均低于敲低野生型株感染组（p<0.05）。（2）特异性的敲低ASC的表达后,敲低组中敲除株感染组与敲低野生型株感染组内NLRP3炎症小体相关蛋白及基因m RNA的表达量变化小（p>0.05）,敲低组与阴性对照之间的差异无统计学意义（p>0.05）。第三部分:MG-132抑制蛋白酶体的泛素化降解对鲍曼不动杆菌感染的影响（1）敲除菌株构建的体内/体外感染模型均显示:MG-132处理后各组内Caspase-1m RNA的水平变化不大即Caspase-1m RNA的合成没有增多（p>0.05）,但Caspase-1P10/P20蛋白的表达明显升高（p<0.05）,这种现象可能是MG-132抑制蛋白酶体对Caspase-1的降解所致。体内模型的病理结果显示在MG-132干预后炎症损伤加重,同时体内/体外MG-132干预模型组NLRP3炎症小体相关蛋白IL-1β、IL-18、ASC和泛素蛋白PD41/K48/K63及ELISA检测的IL-1β、IL-18和NLRP3、IL-1βm RNA的表达量均显著高于对照及敲除株感染组（p<0.05）;体内MG-132干预模型组MPO及组织湿/干比重的比值与其蛋白等表达的结果一致。（2）成功复制野生型菌株构建体内/体外感染模型,体内模型的病理改变在MG-132干预后炎症损伤加重,MG-132干预组NLRP3炎症小体相关蛋白IL-1β、IL-18、ASC、Caspase-1P10/P20和泛素蛋白PD41/K48/K63及ELISA检测的IL-1β、IL-18和NLRP3、IL-1βm RNA的表达量均显著高于对照及野生型株感染组（p<0.05）,而Caspase-1m RNA的合成无明显变化,体内MG-132干预模型组MPO及组织湿/干比重的比值与其蛋白等表达的结果一致,故推断Omp A依赖Caspase-1途径加剧对机体的损伤。结论:（1）鲍曼不动杆菌可以经Omp A激活NLRP3炎症小体通路,引起炎性损伤,且可能与NLRP3/Caspase-1途径相关。（2）MG-132可通过抑制Caspase-1降解,加剧鲍曼不动杆菌感染后炎性损伤,为临床寻找有效治疗靶点提供一定的理论依据。