【摘 要】
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湖南稷子（Echinochloafrumentacea（Roxb.）Link）是一类优质的草料兼农作物,是盐碱地栽培的重要牧草和经济作物。但湖南稷子遗传结构复杂,基因组庞大,导致国内对湖南稷子的研究少之又少,在作物遗传育种和作物改良等相关方面的进展落后。基因编辑育种周期短,可以精确定位编辑目的基因,有效去除假阳性,提高育种效率,在分子育种中的应用十分广泛。遗传转化体系的建立是基因编辑成功的前提,目
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湖南稷子（Echinochloafrumentacea（Roxb.）Link）是一类优质的草料兼农作物,是盐碱地栽培的重要牧草和经济作物。但湖南稷子遗传结构复杂,基因组庞大,导致国内对湖南稷子的研究少之又少,在作物遗传育种和作物改良等相关方面的进展落后。基因编辑育种周期短,可以精确定位编辑目的基因,有效去除假阳性,提高育种效率,在分子育种中的应用十分广泛。遗传转化体系的建立是基因编辑成功的前提,目前对牧草的遗传转化研究已有报道,但对湖南稷子相关的研究进展还停留在生理指标测定。因此利用基因编辑对湖南稷子进行分子方面的研究已是形势所逼。而八氢番茄红素脱氢酶（Phytoenedesaturase,PDS）基因则是验证植物基因编辑是否成功的参照基因,在植物出芽时期便可以看出表型变化,大大缩短了体系建立的时间,并且构建的载体为之后其他基因的敲除提供基础。基于以上原因,本试验以湖南稷子为研究对象,建立湖南稷子完整的再生体系,克隆得到湖南稷子EfPDS部分基因序列,构建CRISPR/Cas9靶向编辑载体,利用根癌农杆菌介导技术初步探索其遗传转化体系,并获得湖南稷子基因编辑再生植株,为湖南稷子遗传转化奠定分子基础,研究结果如下:1.湖南稷子再生体系的建立以N003、N004和宁稷一号三个湖南稷子品种为研究对象,分别以成熟种子和无菌幼苗为外植体进行愈伤组织的诱导,通过重复试验发现:影响湖南稷子再生体系建立的主要因素有外植体种类、基础培养基和激素类型以及浓度。以湖南稷子成熟种子为诱导愈伤的外植体,最终1/2 MS中添加4.0 mg/L 2,4-D后可在N003和宁稷一号两个品种中诱导出长势良好的愈伤组织,愈伤组织平均出愈率达89.71%,并且愈伤组织颗粒状明显、无水渍、颜色淡黄、状态良好。在MS基础培养基中添加2mg/LKT和0.5mg/L 6-BA其分化效果最佳,7-10d就能分化出再生幼苗。在1/2 MS培养基中不添加任何激素的情况下再生幼苗的生根能力最佳。最后将分化再生的完整植株炼苗移栽至土:蛭石（3:1）的基质中,移栽成活率为100%。在以湖南稷子无菌幼苗作为外植体时,多次进行条件筛选诱导率均低于20%,且愈伤组织水渍严重,不利于进一步继代。因此确定以湖南稷子成熟种子为外植体构建了完整的湖南稷子再生体系。2.湖南稷子EfPDS基因的克隆以及靶向编辑载体的构建本研究中利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,以湖南稷子EfPDS为目标基因,首先利用同源克隆技术扩增出湖南稷子EfPDS基因的部分CDS序列,片段长1068bp,在CDS序列的第一外显子和第二外显子处设计双靶位点,以CmYLCV-pBUE411为载体骨架,利用CmYLCV病毒启动子结合tRNA表达sgRNA,BsaI酶切位点加入靶点,使用玉米UBI启动子表达Cas9,以pBUE411载体为模板,经过Cas9序列密码子优化,成功构建了湖南稷子PDS基因双靶点基因编辑载体。3.湖南稷子遗传转化体系的建立及分子鉴定将成功构建的CRISPR/Cas9基因编辑载体重组质粒转化至农杆菌GV3101,菌落鉴定出阳性单克隆并对诱导出的愈伤组织进行侵染,重复试验确定湖南稷子农杆菌介导的最佳转化条件为:菌液OD值0.6-0.7之间;农杆菌侵染时间11-15 min;适宜的共培养时间2d。筛选出最适的继代培养基为1/2 MS,诱导再生培养基为MS+2.0 mg/L KT+0.5 mg/L 6-BA+500 uL cef,抗性筛选培养基为 MS+4 mg/L2,4-D+0.5 mg/L 6-BA+1g/L L-proline+筛选剂草丁膦1mg/L+cef300L（pH7.0）,生根培养基为1/2MS,最终得到基因编辑后的湖南稷子遗传转化植株并对其进行PCR分子鉴定,以载体质粒和野生湖南稷子DNA分别作为阳性和阴性对照,利用CmYLCV-SEQ和CmYLCV-R为引物扩增片段大小为531 bp即阳性植株,验证结果显示正确。
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