[研究背景与目的]转移生态位的免疫抑制环境是肿瘤转移致死的关键原因。这一免疫抑制环境主要由髓源性抑制细胞（Myeloid-derived suppressor cells,MDSC）、肿瘤相关的巨噬细胞（Tumour-associated macrophages,TAM）、中性粒细胞等构成1。在转移生态位中肿瘤细胞不仅可以直接招募这些免疫抑制细胞,也可以将正常免疫细胞从抑肿瘤表型转变为促肿瘤表型,从而加剧免疫抑制的程度,促进肿瘤转移。血管内皮细胞是影响转移生态位形成的另一重要因素。血管内皮细胞常常通过抗原呈递、调节免疫细胞的招募、分泌细胞因子调节淋巴迁移等途径,与免疫细胞共同促进转移生态位的形成。因此同时靶向免疫抑制环境与血管内皮细胞功能或许能为肿瘤转移的防治带来新的曙光。传统中药蕴藏着巨大的宝藏,为肿瘤防治提供新的可能。我们从传统中药中寻找到益气代表药人参,发现其在肿瘤治疗中具有多重免疫调节作用,该作用可能与调节免疫细胞分化和功能以及靶向免疫检查点改善机体免疫抑制状态有关。此外,课题组长期研究结果及国内外文献显示活血化瘀代表药丹参能够通过抑制内皮细胞凋亡、调节黏附分子表达等途径改善内皮细胞功能。人参与丹参配伍或许能够分别作用于转移生态位中免疫抑制状态与血管内皮功能,共同抑制肿瘤转移。本研究以转移生态位的形成为切入点,以传统中药人参、丹参为研究对象,探讨其配伍使用对肿瘤转移的影响及内在机制。希望本研究能为中药治疗肿瘤提供新的依据,也为益气药与活血药的配伍赋予新的科学内涵。[研究方法与结果]本课题第一部分基于Lewis、A549细胞株构建的尾静脉肺转移模型以及MMTV-PyMT自发性乳腺癌肺转移模型,通过小动物活体成像、H＆E染色等技术,从体内水平探究了人参-丹参配伍是否对肿瘤转移具有抑制作用。通过比较人参、丹参单给药与人参-丹参配伍给药的药效,从整体动物水平评价人参与丹参对抗肿瘤转移作用的贡献度,结果显示丹参与人参配伍使用,能够增强人参抑制肿瘤转移的能力。本课题第二部分运用转录组测序技术研究癌旁组织转移生态位基因表达谱的变化,并通过对差异基因进行通路富集分析寻找人参-丹参配伍抑制肿瘤转移的潜在靶标。富集分析结果显示人参-丹参配伍可能通过影响免疫反应和细胞粘附过程发挥抑制肿瘤转移的作用。本课题第三部分首先采用多色流式细胞染色、免疫组化、免疫荧光、luminex多因子检测及qPCR技术发现人参-丹参配伍对转移生态位免疫细胞中的中性粒细胞数量影响最为显著。在接种肿瘤细胞后的不同时间点处死小鼠,对肺组织中性粒细胞进行检测以探究中性粒细胞募集与肿瘤转移之间的因果关系。流式细胞术定量结果显示中性粒细胞募集发生在微转移灶形成之前,提示中性粒细胞可能对肿瘤转移灶形成具有支持作用。使用抗Ly6G的磁珠分选肺组织中性粒细胞与肿瘤细胞共培养,并通过Edu染色、Transwell 小室、间质上皮转化（Mesenchymal-epithelial transition,MET）相关基因检测,体外证明了中性粒细胞对肿瘤增殖、定植、迁移的直接促进作用。中性粒细胞的这一促肿瘤转移作用在给予人参-丹参治疗后被显著逆转。本课题第四部分首先采用中性粒细胞粘附实验和N1/N2表型检测发现,人参-丹参通过调节中性粒-内皮粘附过程与极化过程从而影响其募集和功能。通过原代中性粒细胞转录组测序,并结合之前的癌旁转录组测序结果对内在机制进行探索,发现人参-丹参抑制中性粒细胞募集的机制可能与降低内皮细胞表面粘附分子Sele表达及中性粒细胞表面Sele配体（Glg1、Cd44）表达有关,而调节中性粒细胞极化的机制可能与降低转录因子Cdk2表达有关。利用胰岛血管内皮细胞MS-1与具有类中性粒细胞表型的HL-60细胞进行qPCR验证,并通过加入靶点小分子抑制剂的方法反向验证人参-丹参配伍确实通过这些靶点发挥调节中性粒细胞募集与功能的作用。通过计算机虚拟对接筛选人参、丹参中可能作用于各个靶点的潜力成分。本课题第五部分采用注射Ly6G中和抗体的方法耗竭Lewis、A549尾静脉肺转移模型以及MMTV-PyMT自发性乳腺癌转移模型体内的中性粒细胞,运用与药效评价中相同的实验方法以确定中性粒细胞在人参-丹参配伍抑制肿瘤转移中的关键地位。[结论与意义]本课题基于实验性转移模型与自发性转移模型,从多细胞多模型层面阐明了人参-丹参配伍对肿瘤转移的抑制作用。采用多色流式细胞染色结合转录组测序分析,寻找人参-丹参配伍抑制肿瘤转移的靶点,发现人参-丹参作用于中性粒细胞粘附与极化过程调节转移生态位中中性粒细胞募集与功能,从而抑制肿瘤转移。本课题为临床使用人参-丹参配伍抗肿瘤转移提供理论和实验依据。