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目的:探讨用卡莫司汀(1-3-bis-chloroethyl-nitrosourea,BCNU)建立皮质发育障碍(disorder of cortical developments,DCDs)模型的最佳剂量和方法;探索DCDs模型鼠海马神经元的凋亡机制及与之相关的致痫机制;评价神经示踪剂生物素葡聚糖胺(biotin dextran amine,BDA)对大鼠皮质和海马神经元形态学示踪的应用价值,为DCDs的异常神经网络研究打下基础;观察托吡酯治疗皮质发育障碍所致难治性癫痫(intractable epilepsy,IE)的疗效。方法:1 BCNU诱导大鼠皮质发育障碍模型的建立采用不同剂量的BCNU (以BCNU 5～20mg/kg梯度剂量)给妊娠17天的Sprague-Dawley (SD)大鼠作腹腔注射,建立子代SD大鼠DCDs模型。按BCNU的不同注射剂量分为模型①组(BCNU 5 mg/kg)、模型②组(BCNU 10 mg/kg)、模型③组(BCNU 15 mg/kg)和模型④组(BCNU 20 mg/kg),同时设立对照组。对各模型组仔鼠进行以下观察:①统计各组仔鼠的存活率;观察各组仔鼠出生时一般状态及出生后行为学,包括意识状态、生活能力、有无癫痫发作等。②分别于出生后当天(P0)、出生后7天(P7)、14天( P14)、21天( P21)、56天(P56)和84天(P84)时间点测量各组仔鼠体重。③采用Morris水迷宫实验测试各组仔鼠学习和空间记忆能力。④红藻氨酸诱导各组仔鼠癫痫发作,比较其痫性发作阈值和死亡率。⑤于P21、P84两时间点取各组仔鼠大脑观察其大体形态、测脑湿重;常规病理检查,观察各组仔鼠大脑皮质和海马结构,确定是否存在DCDs以及DCDs的病理类型。2. DCDs模型大鼠海马神经元bcl-2、bax基因的表达用BCNU诱导建立SD大鼠皮质发育障碍动物模型,在仔鼠出生后P0、P15、P30、P45和P60天时,模型组和对照组均用TUNEL检测海马区的凋亡细胞数目,免疫组化和RT-PCR方法检测bcl-2和bax基因在mRNA和蛋白水平表达的变化,并用图像分析系统进行结果分析。3.生物素葡聚糖胺(BDA)对皮质神经元的示踪采用成年的SD大鼠,用牙科钻开颅形成左右对称的4个3mm直径的圆形骨窗,用微量注射器将10%BDA缓慢注射入运动感觉皮质区和海马区,注射总量4ul。存活14d后,取出脑组织在低温冰箱中保存,冰冻切片后,采用自由漂片法行BDA染色,观察BDA标记神经元的形态。4.托吡酯治疗DCDs致难治性癫痫的疗效观察收集经MRI和临床确诊的100例DCDs致IE患者,给予托吡酯(100mg.d-1～200mg.d-1 )单药治疗,与基线发作频率比较,探讨新一代抗癫痫药物托吡酯对DCDs所致难治性癫痫的疗效。结果:1 BCNU诱导大鼠皮质发育障碍模型评估1)仔鼠的存活率对照组与模型①、②、③和④各组仔鼠的存活率分别为100%、100%、93.1%、83.3%和0%,模型④组仔鼠出生当日全部死亡。2)仔鼠的行为学观察模型①组仔鼠的各项观察指标与对照组无差别;模型②组仔鼠出生后日常行为与对照组无明显差异;模型③组仔鼠出生时一般状态较正常对照组差,出现活反应迟钝、活动减少、智能障碍等表现。各模型组没有观察到自发性癫痫发作。3)仔鼠的生长发育情况模型①组仔鼠生长发育情况与对照组无差别(P>0.05);模型②组出生时体重轻度降低(P<0.05),但随着鼠龄的增长两组间没有差异;模型③组仔鼠各时间点平均体重明显降低,随鼠龄的增长两组间差别越显著(P<0.05)。4)仔鼠的水迷宫实验与对照组相比,模型①组仔鼠水中逃避潜伏期及跨过原平台次数无统计学意义(P>0.05);模型②组仔鼠第1、2天水中逃避潜伏期比对照组仔鼠延长(P<0.05),第3、4天无统计学差异,跨过原平台次数与对照组无差异(P>0.05);模型③组仔鼠水中逃避潜伏期始终较对照组延长,第5天撤除平台后,跨过原平台所在位置的次数明显少于对照组(P<0.05)。5)仔鼠的红藻氨酸诱发癫痫发作实验模型①组仔鼠癫痫发作的潜伏期和持续时间及死亡率与对照组比较无差别(P>0.05);模型②组仔鼠癫痫发作的潜伏期缩短(P<0.05),但癫痫发作持续时间及死亡率与对照组比较无统计学差异(P>0.05);模型③组仔鼠痫性发作的潜伏期缩短,癫痫持续状态时间较对照组延长,且死亡率明显高于对照组(P<0.05)。6)仔鼠的大脑组织形态、脑湿重及病理学比较模型①组仔鼠大脑形态和脑湿重与对照组相比无差异,无DCDs病理改变;模型②组仔鼠大脑外形及脑湿重与对照组无明显差别(P>0.05),DCDs发生率为41.67%;模型③组仔鼠脑组织重量减轻、形态异常,随着鼠龄的增长差别越明显,DCDs发生率为100%。典型病理改变包括:大脑皮质厚度变薄、层状结构紊乱、神经细胞缺失或者发育不良,皮质及海马神经元异位等,类似于人类皮质发育不良和神经元结节状异位。2 DCDs模型大鼠海马神经元bcl-2、bax表达TUNEL、免疫组化和RT-PCR检测结果显示:与相应时间点的对照组比较,P0时模型组海马区神经元凋亡和bax、bcl-2在mRNA和蛋白水平表达无明显变化;而在P15、P30、P45、P60时模型组神经元凋亡细胞数逐渐增加,有显著差异(P<0.05),模型组海马神经元bax、bcl-2在mRNA和蛋白水平表达以及Bax/Bcl-2比值均较对照组增高,具有显著统计学意义(p<0.05)。3生物素葡聚糖胺(BDA)对皮质神经元的示踪在大脑皮质层和海马区注射BDA后,皮质、海马神经元吸收良好,可以清楚看到神经元的胞体、树突及轴突。4托吡酯对DCDs致IE的疗效观察100例中37例完全停止发作,33例发作频率减少≥75%,20例发作频率减少≥50%,托吡酯治疗DCDs致IE的总有效率90%,无明显不良反应。结论:1.给予孕17d SD大鼠腹腔注射BCNU 15mg/kg可以制作出理想的DCDs动物(大鼠)模型,而腹腔注射BCNU5mg/kg、10mg/kg和20 mg/kg不能成功建立DCDs模型;DCDs模型仔鼠生长发育差、行为学异常、学习记忆障碍、癫痫发作阈值低,具有典型的DCDs病理改变,很好地模拟人类DCDs的行为学和病理学特征;本模型仔鼠DCDs能作为人类大脑皮质发育不良及神经元异位的动物模型,与国外孕15d腹腔注射BCU N20mg/kg模型相比仔鼠存活率更高,操作简单,是一种新的、实用的DCDs动物模型。2.皮质发育障碍模型鼠海马区神经元在P0时凋亡和正常鼠没有差异,而在P15、P30、P45、P60时存在显著的凋亡,与相应时间点的对照组比较有显著的差异;凋亡基因bax、bcl-2在mRNA和蛋白水平表达以及bax/bcl-2在P0时没有差异,而在P15、P30、P45、P60时,与相应时间点的对照组比较均增高,有显著的差异,说明bax、bcl-2参与了其凋亡过程,皮质发育障碍模型鼠海马神经元凋亡可能与皮质发育障碍所致癫痫和难治性癫痫等临床症状密切相关。3. BDA能较好的显示皮质和海马神经元的胞体、轴突和树突,并具有生物性稳定好、转运距离远等优点,实验方法简单,为大鼠皮质和海马神经元的形态学研究和本课题组对皮质发育障碍的与癫痫和难治性癫痫相关的异常神经网络研究提供了可靠的技术平台。4.新一代抗癫痫药物托吡酯单药治疗DCDs所致IE的控制率、显效率和有效率好,无严重的副作用,可以作为DCDs所致IE的首选药物。