美国白蛾Hyphantria cunea(Drury)原生于北美洲,是一种非常猖厥的危险性害虫,为世界性检疫对象。目前美国白蛾已成为我国最重要的外来入侵种之一,防控形势十分严峻。昆虫依靠其高度灵敏的嗅觉感受系统进行生存和繁衍,即便在几公里外,雄性蛾的触角也可以探测到雌性蛾释放的性信息素。蛾类昆虫的性信息素根据化学结构的不同,分为Type Ⅰ的直链脂肪酸衍生物和Type Ⅱ的多烯烃类的环氧化合物两大类。美国白蛾是Type Ⅰ与Type Ⅱ型均有的混合型性信息素体系,因此,利用生物化学与分子生物学技术,深入研究美国白蛾性信息素结合蛋白、普通气味结合蛋白和信息素受体的功能,尤其是与Type Ⅰ和Type Ⅱ性信息素进行特异性结合以及精确识别等问题,有利于解析蛾类信息素结构与嗅觉通讯进化机制。本实验利用原核表达系统获得大量目的蛋白,然后利用荧光竞争性结合实验(Fluorescence competitive binding assays)的方法,测定了 PBP和GOBP对美国白蛾性信息素以及植物挥发物的结合能力。利用爪蟾卵母细胞异源表达系统结合双电极电压钳技术,研究美国白蛾性信息素受体PR3对美国白蛾性信息素的反应谱。1.美国白蛾性信息结合蛋白的鉴定和功能分析利用qPCR技术研究美国白蛾3个PBP在成虫不同组织的相对表达量,结果表明,美国白蛾3个PBP均在雌雄虫触角中高表达,其中HcunPBP1雄虫是雌虫表达量的6.5倍;HcunPBP2雄虫是雌虫表达量的1.7倍;HcunPBP3雄虫是雌虫表达量的4.2倍。利用原核表达系统、组氨酸标签蛋白Ni磁珠纯化技术和荧光竞争性结合实验,测定了美国白蛾3个PBP对四种性信息素组分和24种植物挥发物的结合能力。结果表明,美国白蛾3个PBP与Type Ⅰ性信息素组分均有较强的结合能力(Ki<1.0 μM),而与Type Ⅱ性信息素组分的结合有着明显的差异。其中HcunPBP2与Type Ⅱ性信息素组分1,Z3,Z6-9S,10R-epoxy-21Hy的结合能力较强,HcunPBP3有中等结合能力,而HcunPBP1没有结合能力;HcunPBP1和HcunPBP3均与Type Ⅱ性信息素组分Z3,Z6-9S,10R-epoxy-21Hy有中等的结合能力,而HcunPBP2没有结合能力。此外,在测试的24种植物挥发性物质中,3个PBP均能选择性与部分植物挥发物结合,且具有较强的结合能力(Ki<10.0 μM)。结合我们的研究结果,我们推测美国白蛾3个PBP具有明显的功能分化,在感受雌蛾释放的性信息素组分有着明显得偏好性,而除了感受雌蛾性信息素外,PBP还能参与一些植物气味的感受。2.美国白蛾普通气味结合蛋白的鉴定和功能分析跟据实验室已有的美国白蛾触角转录组数据,克隆出美国白蛾2个GOBP的基因序列,并对2个GOBP基因的表达谱和气味结合特性进行了系统分析。qPCR结果表明,美国白蛾HcunGOBP1和HcunGOBP2均在雌雄虫触角中高表达,且在雌雄蛾间的表达量水平相当。然而HcunGOBP2在雌虫触角的表达量是HcunGOBP1的4.6倍,在雄虫触角的表达量是HcunGOBP1的5.1倍。另外,在不含触角的组织中仅有极低或没有表达。荧光竞争性结合实验结果表明,HcunGOBP2与Type Ⅰ性信息素组分有较强的结合能力,而与Type Ⅱ性信息素组分没有结合能力;HcunGOBP1对4种信息素组分均没有结合能力。在测试的24种植物挥发物中,美国白蛾2个GOBP均与部分植物挥发物有着不同程度的结合能力(Ki=9-50μM),而与所选的大部分植物挥发物没有结合能力。综上所述,美国白蛾2个GOBP在气味物质感受方面具有功能分化的特点:HcunGOBP1可能仅用于植物挥发物的识别而不参与性信息素的识别;而HcunGOBP2可能参与Type Ⅰ性信息素组分的识别。3.美国白蛾性信息素受体的功能分析通过同源克隆技术克隆了美国白蛾典型嗅觉受体Orco和性信息素受体PR3基因的cDNA全长,并利用非洲爪蟾卵母细胞表达系统结合双电极电压钳技术测定了HcunPR3/Orco对美国白蛾四种性信息素组分的识别特异性;测定结果显示HcunPR3/Orco能够特异性识别性信息素组分1,Z3,Z6-9S,10R-epoxy-21Hy,而对其他性信息素组分都没有识别能力。当1,Z3,Z6-9S,10R-epoxy-21Hy的浓度为10-3M时能激发HcunPR3/Orco产生最大反应,EC50=1.74x10-5 M;而对Type Ⅰ信息素组分和另外一种Type Ⅱ性信息素组分未表现出生理反应。该研究结果对进一步阐明Type Ⅱ性信息素的分子感受机制奠定基础,对于其它具有Type Ⅱ型性信息素的蛾类昆虫嗅觉感受机制研究具有重要意义。