我国大部分绵羊为季节性发情品种,其发情的季节性特点一直是制约绵羊生产繁殖效率的瓶颈。在绵羊的实际生产中,受外界环境因素的影响,部分绵羊品种在非繁殖季节也出现发情性状,但要使其稳定地进行常年发情,就必须了解这种在非繁殖季节表现发情的分子调控机理。哺乳动物的生殖活动主要依赖于下丘脑-垂体-性腺轴的调节,而对miRNA的研究可以从多个途径发现更多的参与调控的基因。而对小分子非编码RNA(Small non-coding RNA)的研究可以从多个途径发现更多的参与调控的基因。鉴于此,本研究以哈萨克羊为研究对象,采用高通量测序技术,构建非繁殖季节与繁殖季节发情绵羊下丘脑-垂体-卵巢组织文库,筛选由季节因素引起的差异表达miRNA及其靶基因,以期为改变绵羊的季节性发情提供一种参考。具体研究内容如下:1.本实验利用高通量测序技术构建了以繁殖季节发情绵羊(EB)为对照组,以非繁殖季节发情绵羊(EN)为实验组的下丘脑(H)、垂体(P)、卵巢(O)组织小RNA文库,并进行生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR的方法对高通量测序结果进行验证。同时对预测到的靶基因进行GO富集和KEGG富集分析。结果显示:(1)?下丘脑(HEN vs HEB)两文库相比,有15个已知和126个未知miRNAs表达差异显著;?垂体(PEN vs PEB)两文库相比,有12个已知和114个未知miRNAs表达差异显著;?卵巢(OEN vs OEB)两文库比较发现,有48个已知和135个未知miRNAs表达差异显著;(4)oar-miR-136和oar-miR-148a为下丘脑-垂体-卵巢组织中共同差异表达的miRNAs。(2)随机选择的6个miRNAs(4个已知和2个新发现的),经过实时荧光定量PCR验证,其表达趋势与测序结果一致,证明测序结果的真实性。(3)通过软件预测出靶基因并进行GO分析发现,以上文库涉及细胞过程、发育过程、生长过程、代谢过程、生物调节过程、催化活性、繁殖过程和酶调节活性过程等。对其调控通路进行KEGG分析,发现有哺乳动物的昼夜节律通路、GnRH信号通路、孕酮介导的卵母细胞成熟通路、胰岛素信号通路、类固醇激素的合成通路以及黑色素的生成等通路。2.利用靶基因预测软件和KEGG通路筛选oar-miR-136和oar-miR-148a的靶基因,oar-miR-136获得PLCB1和GNAQ两个潜在的靶基因,oar-miR-148a获得PLCB1和NRAS两个潜在的靶基因。构建野生型和突变型双荧光素酶载体,转染Hela细胞,比较双荧光素酶活性。结果显示,oar-miR-136只对野生型GNAQ重组质粒表达的双荧光素酶活性有显著地抑制效果(P<0.01),说明oar-miR-136和GNAQ基因存在靶关系;而oar-miR-148a只对野生型PLCB1重组质粒表达的双荧光素酶活性有显著地抑制效果(P<0.05),说明oar-miR-148a和PLCB1基因存在靶关系。3.利用miR-136 minic和miR-148a minic转染至下丘脑神经细胞,选择发情相关基因(KiSS-1、GPR54、TSHB、RFRP、DIO2、DIO3和GnRH)进行实时荧光定量检测。利用miR-136 minic和miR-148a minic转染至卵巢颗粒细胞,选择激素相关基因(ERβ、PR和INHBA)进行实时荧光定量检测。结果显示:(1)转染下丘脑神经细胞后,与对照组相比,对于miR-136而言,GNAQ基因显著下调,发情相关基因KiSS-1、DIO2、RFRP和Gn RH基因显著上调(P<0.05),TSHB基因显著下调(P<0.05),GPR54和DIO3基因变化不显著。对于miR-148a而言,PLCB1基因显著下调(P<0.05),发情相关基因KiSS-1和GPR54基因显著上调(P<0.05),其他基因没有显著变化。(2)转染卵巢颗粒细胞后,与对照组相比,对于miR-136而言,GNAQ基因表达量升高(P<0.05),激素相关ERβ基因表达量显著下调(P<0.05)外,另外两个PR和INHBA基因无显著性的变化。对于miR-148a而言,与对照组相比,PLCB1基因表达量显著下调(P<0.01),激素相关基因ERβ、PR和INHBA基因表达量显著上调(P<0.01)。说明miR-136通过抑制靶基因的表达对发情相关基因起调控作用,miR-148a通过抑制靶基因的表达对激素相关基因起调控作用,最终调控卵泡的发育,进而对发情起一定作用。综上所述,利用高通量测序技术成功构建了非繁殖季节和繁殖季节发情绵羊下丘脑-垂体-卵巢小RNA文库,筛选差异表达的miRNAs,结合KEGG通路以及预测软件进行靶基因的预测,同时对特定miRNAs的候选靶基因进行验证,最后在细胞水平对靶基因功能进行验证。所得的结果为深入挖掘miRNA在季节性发情中的作用奠定基础,从而为实现绵羊在非繁殖季节发情提供参考依据。