西兰花中硫代葡萄糖苷(简称硫苷)是一类含氮和硫的次生代谢产物,其在黑芥子酶(MYR)作用下生成异硫氰酸酯、硫氰酸盐、腈类和2-S恶唑烷等。萝卜硫苷(GRA)是西兰花中含量最多的硫苷,占总硫苷的50%以上,在MYR作用下水解,生成萝卜硫素。萝卜硫素是迄今为止发现的抗癌作用最强的天然植物活性成分。然而,当表皮特异硫蛋白(ESP)存在时,GRA会朝着没有抗癌功能的萝卜硫腈方向水解,降低萝卜硫素产量。因此,萝卜硫素形成量与GRA含量、MYR和ESP蛋白活性有关。GRA和萝卜硫素在西兰花种子和芽苗中含量较多,西兰花芽苗中GRA和萝卜硫素含量是成熟西兰花的10～100倍,因而西兰花芽苗作为一种保健型蔬菜日益受到关注。植物在逆境条件下,硫苷会大量积累,脱落酸(ABA)和茉莉酸(JA)含量增加并缓解胁迫。JA作为信号分子在硫苷合成过程中起重要调控作用,而ABA作为逆境缓和激素调控硫苷的报道较少。本研究从生理代谢水平、酶水平、激素水平、基因水平和蛋白质水平探讨热激、低氧胁迫及JA和ABA处理调控西兰花芽苗中GRA和萝卜硫素的机制。主要研究结果如下:1、研究了西兰花种子发芽过程中抗坏血酸、总酚、花色苷、抗氧化能力变化及硫苷、MYR和萝卜硫素时空分布。西兰花芽苗中抗坏血酸和花色苷含量在发芽0～7 d先增加后降低,总酚、GRA和萝卜硫素含量不断下降,MYR活性在0～3d无显著差异,随后逐渐增强,第7天约增加到初始的3倍,抗氧化能力在第2天达到最高;GRA是西兰花芽苗中含量最多的硫苷,约占总硫苷的70%,西兰花种子在25℃下发芽较20℃和30℃有利于GRA和萝卜硫素的富集;GRA和萝卜硫素在子叶中含量最多,占芽苗中GRA和萝卜硫素含量的93%以上,但是子叶中MYR活性显著低于胚轴和根;在西兰花种子、芽苗、子叶及胚轴中含量最多的酶解产物均是萝卜硫素,而根中主要的酶解产物是4-甲硫基丁腈和丁基异硫氰酸酯。2、研究了热激、低氧及其联合胁迫对西兰花芽苗生理代谢及GRA和萝卜硫素的影响。热激胁迫下,西兰花芽苗中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性较对照显著增加,而低氧胁迫下,芽苗中POD和GPX活性较对照显著降低,SOD和CAT活性增加;联合胁迫下西兰花芽苗中SOD、CAT、POD和GPX活力低于热激胁迫高于低氧胁迫;热激处理下西兰花芽苗的抗氧化能力最强,联合胁迫次之,对照最低。ABA是西兰花芽苗中含量最高的激素,JA次之;各胁迫处理显著提高了西兰花芽苗中JA、ABA和油菜素内酯(BR)含量,对水杨酸(SA)和赤霉素(GA)无显著影响,降低了乙烯(ETH)含量。各胁迫处理显著提高了西兰花芽苗中3-丁烯基硫苷(GNA)、GRA和4-甲硫基丁基硫苷(GER)及总硫苷的积累,但是热激联合低氧胁迫并没有显示出热激胁迫和低氧胁迫的协同叠加作用,热激胁迫下西兰花芽苗中GNA和GER含量低于低氧胁迫,联合胁迫下各硫苷及总硫苷含量与低氧胁迫无显著差异。热激胁迫处理下,7 d西兰花芽苗中MYR和ESP蛋白活性较对照分别降低了39.41%和64.28%,低氧胁迫处理下,7 d芽苗中MYR活性较对照降低了11.90%,ESP蛋白活性提高了34.30%,联合胁迫下,MYR活性与低氧胁迫无显著差异,ESP蛋白活性与对照无显著差异。热激胁迫下西兰花芽苗中萝卜硫素形成量高于低氧及联合胁迫,7 d热激胁迫的西兰花芽苗中萝卜硫素的形成量是对照的2.54倍、低氧的1.30倍。3、研究了JA和ABA对西兰花芽苗中GRA和萝卜硫素的调节作用。西兰花芽苗经100μM JA处理后,7 d芽苗中GRA和总硫苷含量分别较对照平均提高了2.01倍和2.53倍;100μM JA处理提高了5d和7d芽苗中MYR活性,对ESP蛋白活性无显著影响,200μ和300μM JA提高了各生长阶段芽苗MYR活性和ESP蛋白活性;在5 d和7 d芽苗中,100μM JA处理下萝卜硫素含量是对照的1.95倍和3.36倍,高于300μM JA处理。对于各生长阶段的西兰花芽苗,ABA处理后GRA和总硫苷含量显著提高,但50μM和75μMABA之间无显著差异;喷施50μMABA后,3d、5d和7d芽苗中GRA含量较对照分别增加了16.64%、62.52%和97.17%,总硫苷分别增加了18.58%、70.36%和109.61%;ABA提高了5 d和7 d芽苗MYR和ESP蛋白活性,ABA处理后西兰花芽苗中萝卜硫素形成量显著提高,但是50μ和75μM之间无显著差异。4、采用RACE(Rapid-amplification of cDNA ends)技术,设计兼并引物、3’和5’端特异性引物,克隆西兰花芽苗CYP79F1、CYP83A1、UGT74B1、ST5b和FMOGS-OX1基因。将中间片段、上游及下游cDNA序列拼接得到1980 bp、1652 bp、1592 bp、1378 bp和1623 bp的基因序列(包括部分内含子)。运用DNAStar和BioXM在线软件分析序列,发现CYP79F1基因序列包含1623 bp的开放阅读框,编码540个氨基酸;CYP83A1基因序列包含1506 bp的开放阅读框,编码501个氨基酸;UGT74B1基因序列包含1401 bp的开放阅读框,编码466个氨基酸;ST5b基因序列包含1029 bp的开放阅读框,编码342个氨基酸;FMOGS-OX1基因序列包含1386 bp的开放阅读框,编码461个氨基酸。5、热激胁迫下,西兰花芽苗中GRA合成基因Elong、CYP83A1和FMOGS-OX1的表达显著上调,萝卜硫素形成基因MYR和ESP的表达降低;通过蛋白组学分析,成功鉴定出146个差异表达蛋白,这些差异蛋白主要涉及防御、蛋白质合成、能量、碳水化合物代谢、氨基酸代谢和次生代谢等功能,分布于叶绿体、细胞质、线粒体和细胞核等部位。热激胁迫降低了西兰花芽苗中S-腺苷甲硫氨酸合成酶1(SAM1)、S-腺苷甲硫氨酸合成酶2(SAM2)和S-腺苷甲硫氨酸合成酶4(SAM4)的表达,提高了3-异丙基苹果酸脱氢酶(IPMDH)、3-异丙基苹果酸脱氢酶大亚基(IIL1)和3-异丙基苹果酸脱氢酶小亚基3(IPMDS3)的蛋白表达,降低了ESP蛋白和腈特异蛋白2(NSP2)的表达。6、低氧及联合胁迫下,西兰花芽苗中GRA合成基因Elong、CYP83A1、UGT74B1、ST5b和AOP2的表达显著上调,因此西兰花芽苗经低氧及联合胁迫处理后,GER和GNA含量显著高于热激处理,低氧及联合胁迫提高了芽苗中MYR和ESP基因表达。西兰花芽苗经低氧胁迫后鉴定出91个差异表达蛋白,联合胁迫与热激胁迫相比,检测到106个差异蛋白,与低氧胁迫相比仅检测到19个差异蛋白;低氧及联合胁迫降低了SAM1和SAM2的蛋白表达,提高了IIL1和IPMDS3蛋白表达,低氧胁迫对黑芥子酶MYR1和MYR2的蛋白表达无显著影响,提高了ESP蛋白表达;联合胁迫对MYR1、MYR2、ESP和NSP2的蛋白表达均无显著影响。7、西兰花芽苗经JA处理后,检测到差异蛋白126个,经ABA处理后,鉴定出102个差异蛋白;这些差异蛋白主要参与防御功能、能量、蛋白质合成、碳水化合物代谢、氨基酸代谢、蛋白质折叠和降解、信号转导以及次生代谢等过程,分布于叶绿体、细胞质、细胞核、线粒体以及内质网等部位。JA和ABA显著提高了西兰花芽苗中脂肪族硫苷合成相关转录因子MYB28及相关基因Elong、CYP79F1、CYP83A1、UGT74B1、ST5b、FMOGS-OX1和AOP2的表达,JA提高了IIL1和IPMDS3蛋白表达,ABA提高了IPMDH和IPMDS3蛋白表达,从而增加了GRA的积累;JA提高了5d芽苗MYR基因表达及MYR1和MYR2蛋白表达,对ESP基因表达和蛋白表达无显著影响,ABA提高了MYR和ESP基因表达以及MYR2和ESP蛋白表达,从而调控萝卜硫素的形成。