茶树抗坏血酸过氧化物酶(APX)基因克隆及逆境胁迫下的表达特性与生理响应

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抗坏血酸过氧化物酶(ascorbateperoxidaseAPX)最早发现于20世纪70年代,它是一种存在于高等植物和真核藻类中的亚铁血红素蛋白。近年来关于APX的研究发展较快,特别是APX作为抗坏血酸—谷胱甘肽循环中的关键酶,能够清除植物叶绿体、细胞质和微体中过氧化氢(H2O2)的作用已经引起了人们的广泛关注。APX比其它抗氧化酶对H2O2有更高的亲和力,且叶绿体中尚未发现有清除H2O2的过氧化氢酶(CAT),因此,叶绿体中的H2O2主要是由APX清除的。所以,在逆境胁迫下,APX对于植物维持正常的光合能力具有重要的作用。茶树原产于热带及亚热带地区,是一种喜温暖,湿润气候的的经济作物。而低温和干旱等逆境胁迫一直是茶树分布和产量的限制性因素。因此,茶树抗寒性和抗旱性机制的研究也一直受到极大的关注。本研究从低温诱导茶树SSH文库和茶树全器官转录组文库中分别筛选出1条APX的EST片段,以茶树叶片为试验材料,克隆得到三个APX:微体型APX(MicrobodyAPX)、叶绿体基质型APX(ChloroplasticstromalAPX)和类囊体APX(Chloroplasticthylakoid-boundAPX),并对它们初步的生物信息学进行了预测和分析。通过RT-PCR和qRT-PCR分析研究了不同类型的APX在茶树不同组织中以及自然越冬低温期和干旱胁迫下的表达差异,并对不同茶树品种的APX活性及其叶绿素荧光参数进行了测定。主要研究内容和试验结果如下:1.微体APX,命名为CsmAPX,其中cDNA全长为1158bp,开放阅读框为867bp,编码288个氨基酸,C-端具有定位于过氧化物酶体的跨膜结构;类囊体APX,命名为CstAPX,其cDNA全长为1424bp,开放阅读框为1296bp,编码由431个氨基酸,C-端具有定位于类囊体的跨膜结构;叶绿体基质型APX,命名为CssAPX,cDNA全长为1579bp,开放阅读框为1149bp,编码一个由382个氨基酸,不具有跨膜结构。已将三个基因序列递交到GenBank,登录号分别为:JQ011380、JQ740734和JQ011381。2.多序列同源比对发现3个APX都含有植物抗坏血酸过氧化物酶的2个保守功能结构域:活性位点和亚铁血红素结合位点。此外,sAPX和tAPX也都含有叶绿体型APX的2个保守结构域:(K-N-I-E-E-W-P)和(E-T-K-Y-T-K-D-G-P-G-[A|N]-P-G-G-Q-S)。进化树分析表明CsmAPX、CssAPX、CstAPX和CscAPX(GenBank登录号:EU547804)分属于两大类。3.利用RT-PCR对CsmAPX、CssAPX、CstAPX和CscAPX在茶树不同组织中的表达水平进行了研究。结果表明CscAPX在根、茎和叶中分布均衡不具有组织特异性,而CsmAPX、CstAPX和CscAPX具有组织特异性且主要分布在叶片中。4.以茶树品种“茶农98”、“迎霜”和“舒茶早”的一生年无性系茶苗为试验材料,对其越冬低温期间APX活性、叶绿素荧光参数以及4种APX的表达水平进行了研究。结果表明,品种间的APX活性变化规律一致,先升后降,且均在1月份达到最大值;品种间的叶绿素荧光参数变化规律一致,即Fv/Fm、Fm和Fv/Fo先降后升,Fo先升后降;RT-PCR和qRT-PCR分析表明越冬低温期间cAPX和sAPX的表达水平在12月和1月显著上调,之后下降,而mAPX和tAPX上调程度较小。5.干旱胁迫下,三个品种的APX活性变化规律一致,即随胁迫程度加重先下降后上升再下降;F v/Fm、F m和Fv/Fo随胁迫程度加重不断下降,而Fo不断上升;m APX和tAPX表达水平受干旱胁迫影响程度较小,sAPX在干旱胁迫诱导后显著上调表达,而cAPX的表达却受到干旱胁迫抑制。
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