不孕不育严重影响了人类的生殖健康,全球范围内的育龄夫妇中有10%-15%存在生育困难,其中由男性因素导致的约占30-55%。男性不育多是由精子生成障碍导致的,其中原发性非梗阻性无精子症(Non-obstructive Azoospermia, NOA)是影响较为严重的一种表现形式,其发病率约占男性总数的1%,我国的男性不育患者中有近四分之一是NOA导致的。NOA是一种由于无法正常产生精子从而导致射出的精液中不能发现精子的严重影响生殖功能的疾病,临床上排除输精管梗阻、逆行或无法射精等原因之后,三次连续射精的精液中都没有通过显微镜镜检发现精子的患者被诊断为NOA。在男性不育的诸多影响因素中,遗传因素约占15-30%。近年来随着遗传学研究方法的快速发展,DNA拷贝数变异(Copy Number Variations, CNV)逐渐被人们关注。CNV是一种长度在数千碱基对(Kb)到数百万碱基对(Mb)之间的一种大片段拷贝数改变引起的结构变异。由于CNV覆盖的区域大且通常包含了大量的基因、突变位点以及一些功能性元件,携带大量遗传信息,有研究报道CNV所能解释的表达差异与SNP解释的表达差异是相互独立的,两者几乎没有重叠,提示CNV可以作为SNP研究的互补,肯定了CNV的研究价值。由于目前尚没有中国人群大样本的CNV研究,因此本研究第一部分在中国男性NOA患者中开展了全基因组拷贝数变异研究,并结合后期独立样本的验证来证实初筛阶段发现的中国人群NOA相关的拷贝数变异区域,促进NOA的防治具有一定的现实意义。全基因组关联研究(Genome-wide association study, GWAS)不同于以往的候选基因研究,不需要在研究之前提出病因假设,该研究是通过高密度芯片来实现大规模系统性的筛查从而发现潜在的致病位点。GWAS研究通常采用大样本对全基因组范围内的单核苷酸变异进行初筛,并辅以多阶段多中心的独立验证。但GWAS研究也存在一定的局限性,通常仅纳入常染色体上的SNP位点,忽略了性染色体上所携带的基因信息。在研究男科学疾病时,Y染色体起着性别决定作用,因此对于研究NOA这类男性特有的疾病时,忽略Y染色体上的遗传信息可能会对NOA的病因学研究带来一定程度的影响。“Y染色体单倍群”是针对Y染色体开展的单倍群研究,本课题组前期在东亚人群的研究中发现Y染色体单倍群K*可能承受更高的男性不育的风险。而Y染色体单倍群03e*表现出的则是保护作用。基于Y染色体功能的多样性,我们推断出Y染色体单倍群K*和单倍群03e*可能伴随基因调控原件在精子发生过程中起着危害或保护作用。作为遗传背景中一个主要的因素,Y染色体单倍群可能是一些表型的变异,例如SNPs的一个基础。现有的关联研究仅仅考虑了Y染色体或者仅仅考虑了常染色体,这会导致不同研究人群甚至相同的研究人群结果的不一致性。因此,为了排除疾病关联分析中遗传背景的影响,本研究的第二部分主要研究常染色体多态性位点与NOA关联研究以及常染色体多态性位点与Y染色体单倍群结果的交互分析,本研究结果对于深入阐述人类常染色体多态性与Y染色体单倍群的交互作用在精子发生过程中的作用及其可能的遗传机制有着重要的理论和现实意义,最终为不育症的诊断和治疗提供新的途径和方法。第一部分中国男性非梗阻性无精子症全基因组拷贝数变异研究本课题组前期曾参与了高加索人群无精子症全基因组SNPs和CNVs研究,发现了2名患者存在位于染色体9p24.3区域的DMRT1基因的拷贝数缺失,且后期在本课题组提供的中国汉族男性NOA样本中验证发现3名男性存在该基因的拷贝数缺失。该研究结果提示DMRT1基因的拷贝数缺失可能是人类精子发生障碍的风险因素。由于该项研究的初筛人群为323例高加索无精子症患者,并不能揭示中国汉族男性的拷贝数变异情况,因此,本研究第一部分采用大样本多阶段的病例-对照研究设计,对中国汉族男性进行拷贝数变异的全基因组关联分析,进一步筛查中国人群无精子症拷贝数变异的相关致病基因,随后进一步扩大样本量进行验证,以期证实初筛阶段发现的中国人群NOA相关的拷贝数变异区域。我们假设结构重组的热点区域是分散在整个基因组的,这些重组热点区域会导致罕见的CNV发生,继而导致严重的不育。为了证实这个假设,本研究采用全基因组Affymetrix 6.0芯片在1,000例NOA患者和1,703例有生育史的男性对照样本中进行全基因组拷贝数变异初筛。采用Affy6CNV分析软件对芯片数据进行质量控制以及CNV的鉴定,研究结果支持了我们的假设,即精子发生是受到整个基因组的遗传变异调节的。X染色体尤其富集了很多调节精子发生的基因,X染色体上罕见的大于100Kb的缺失在病例组中的出现频率是对照组的2倍(OR=2.05,P=0.01)。在整个基因组中,我们发现出现单次的拷贝数变异在病例组中的频率是对照组的2.4倍(P<0.02)。并且发现117个基因,例如SYCE1,包含了47个重组热点,很大程度上会导致基因组紊乱从而导致不育。随后采用7900HT Realtime-PCR仪对初筛结果进行技术验证,采用AccuCopy多重基因拷贝数检测试剂盒进行扩大样本验证,扩大样本验证阶段的纳入了1,500例NOA患者和有生育史的1,600例健康男性对照。其中常染色体MAST2基因仅在3例初筛样本中发生拷贝数重复,在验证阶段病例中发现11例拷贝数重复,对照中存在1例拷贝数重复(P<5×10-5)。我们的研究结果证明了不仅仅是Y染色体,整个基因组的突变都会影响精子发生。其中Y染色体的变异对疾病的影响是最大的,其次是X染色体,最后是常染色体。并且发现在染色体上的某个区域表现出罕见CNV在病例组相较于对照组存在富集现象。这些研究结论丰富了我们对于精子发生的理解,更可以对以后的诊断和治疗提供精确的靶点。第二部分中国男性非梗阻性无精子症Y染色体单倍群与全基因组单核苷酸多态性位点交互作用研究由于GWAS通常是对常染色体上的单个多态性位点的研究,忽略了大片段的结构变异以及性染色体上的多态位点,因此,本文的第一部分通过对芯片中的拷贝数变异情况进行分析,得到了与NOA发生有关的拷贝数变异情况；本文的第二部分开展了常染色体多态性与NOA的关联研究,并进一步结合Y染色体单倍群的信息,深入挖掘常染色体多态性与Y染色体单倍群的交互作用。前期已有男性不育的全基因组关联研究报道,但是由于样本量较小,且是在欧洲人群中开展的,研究结果较为局限,因此有必要在中国汉族男性人群中开展一项大样本的GWAS以寻找新的NOA易感位点。我们在中国人群中开展了多阶段的NOA病例对照研究,第一阶段采用Affymetrix 6.0芯片在1,000例NOA患者和1,703例有生育史的男性对照样本中进行初筛。随后通过两阶段扩大样本验证对初筛结果进行验证,第一阶段验证样本为1,180例病例和2,082例对照,基因型分析采用的是TaqMan Openarry等位基因分型技术。第二阶段验证样本为766例病例和1,995例对照,基因型分析采用TaqMan基因分型平台。两阶段验证结果显示PRMT6(位于1p13.3区域的rs12097821), PEX10(位于1p36.32区域的rs2477686)和SOX5(位于12p12.1区域的rs10842262)验证成功,这些位点与NOA发病风险的增加显著相关,提示这些遗传变异可以作为中国汉族男性NOA潜在的易感标志物。本课题组前期在东亚人群的研究中发现Y染色体单倍群K*可能承受更高的男性不育的风险。而Y染色体单倍群03e*表现出的则是保护作用。基于Y染色体功能的多样性,我们推测Y染色体单倍群K*和单倍群03e*可能是伴随着基因调控原件在精子发生过程中发生危害或保护作用。作为遗传背景中一个主要的因素,Y染色体单倍群可能是一些表型的变异,例如SNPs的一个基础。现有的关联研究通常仅考虑了Y染色体或仅考虑了常染色体,这会导致不同研究人群甚至相同的研究人群结果的不一致性。因此,为了排除疾病关联分析中遗传背景的影响,本研究第二部分对所有样本进行Y染色体单倍群分型工作,在此基础上采用大样本病例-对照研究设计,将全基因组关联研究的多态性结果与人类遗传背景Y染色体单倍群资料相结合。Y染色体具有较高的遗传变异性且在性别决定及精子发生方面都起到重要作用。因此,为了研究Y染色体单倍群能否影响常染色体变异的效应,我们在1,000个NOA患者和1,703个有生育史的男性对照GWAS研究的基础上,通过交互作用来研究两者的关联。通过Logistic回归模型,我们发现03e*单倍型在精子发生过程中起到保护作用(OR=0.68,95%CI=0.52-0.89；P=5.55×10-3),随后,我们探索了03e*单倍型与常染色体上的多态性位点之间的潜在交互作用,我们的结果显示在NOA患者中03e*单倍型与rs11135484位点之间存在协同交互作用(OR=2.07,尸=9.89x10-5)。此外,生物信息学分析显示那些显著的SNP位点所在的基因大多富集在免疫相关通路。这是首个在全基因组水平研究Y染色体单倍群与常染色体多态性之间交互作用的研究。本研究结果对于深入阐述人类常染色体多态性与Y染色体单倍群的交互作用在精子发生过程中的作用及其可能的遗传机制有着重要的理论和现实意义,揭示了无精子症的部分发病原因,也为男性不育的致病机制提供了新的启示,最终为不育症的诊断和治疗提供新的途径和方法。