神经元是神经系统的结构和功能单位,在人体的感觉、运动、认知、学习、记忆等多项生理过程中发挥重要作用。当神经元的结构或功能严重缺陷时就会产生各种疾病,最典型的神经系统疾病就是神经退行性疾病,如阿尔兹海默症、帕金森综合症等。该类疾病患者多为中老年,发病早期症状不明显,待出现明显症状时神经系统已经发生不可逆损伤,并且成体神经发生能力弱,药物只能缓解症状、延缓疾病进程,所以该类疾病目前仍无法治愈,然而神经退行性疾病患者人数仍在逐年增加。因此,探究在神经发生过程中的新的关键因子,对于我们深入了解神经元细胞的发育过程,以及对于神经退行性疾病的治疗及预防至关重要。为了寻找与神经元发育相关的重要因子,我们利用斑马鱼作为实验材料,进行ENU诱变,再经过大规模正向遗传筛选,得到了胚胎期中脑区域细胞增殖有明显缺陷的突变体,进一步通过图位克隆及DNA测序,发现该突变体的第18号染色体上一个名为tango6的基因发生了点突变,致使蛋白质翻译提前终止。该基因缺陷严重影响胚胎发育,表现为鱼鳔缺失,头和眼睛变小,而且多在受精后7天死亡。目前关于tango6基因的研究极少,特别是其在神经细胞中的生物学功能还没有研究报道。为了确认突变体中脑区域细胞增殖缺陷的表型是否是由于tango6基因突变导致的,我们分别将野生型及突变型tango6 m RNA显微注射至斑马鱼胚胎中,实验结果显示仅野生型tango6 m RNA可以拯救突变体增殖缺陷的表型。此外,在用CRISPR/Cas9技术敲除得到的tango6突变体中同样发现胚胎中脑区域细胞增殖减少,与正向遗传筛选得到的突变体表型一致,表明该斑马鱼脑部细胞增殖缺陷的表型确实是由于tango6突变导致的。为了寻找tango6基因突变后脑部区域增殖缺陷的细胞类型,我们首先利用原位杂交实验检测了tango6基因的时空表达模式,结果显示tango6基因在斑马鱼胚胎脑部组织中高表达,荧光原位杂交检测发现tango6基因与神经干细胞及祖细胞（NSPCs）标记物nestin及sox2高度共定位,表明tango6基因在斑马鱼的NSPCs中富集表达。因此,我们推断tango6突变后可能对NSPCs细胞产生影响,而NSPCs细胞在胚胎发育早期是各种神经元及胶质细胞产生的源头,一旦NSPCs细胞受损其产生的各谱系的细胞都将受到影响。抗体荧光染色结果表明在tango6突变体中NSPCs细胞增殖减少,成熟神经元细胞数量也明显减少。当在斑马鱼神经元细胞中特异性回补野生型tango6时,tango6突变体的细胞增殖水平显著改善。利用特异性启动子在神经元细胞中特异性过表达野生型tango6时,神经元细胞数量也有增加,表明在胚胎发育时期tango6以细胞自主性的方式促进神经元细胞的增殖。随后,我们探究了tango6突变导致NSPCs增殖缺陷的分子机制。文献表明,转录因子P53是经典的细胞周期阻滞因子,可通过下游的P21等发挥功能,抑制细胞周期相关基因的表达,从而抑制细胞增殖。原位杂交及western blot结果显示,在tango6突变体中P53的表达量显著增加。在野生型斑马鱼中过表达P53可抑制细胞增殖,降低神经元细胞数目,与tango6突变体表型一致。并且,用morpholino敲降P53后可拯救tango6突变体中神经元细胞数目减少以及增殖缺陷的表型。这些结果表明tango6基因突变后可通过激活P53抑制NSPCs细胞的增殖。为了探究tango6突变后激活P53的原因,我们在U251细胞系中利用质谱检测与TANGO6相互作用的蛋白,结果发现TANGO6并不与P53蛋白质相互作用,表明tango6突变后激活P53这一过程中可能有其他因子的参与。通过对质谱结果进一步分析,我们发现TANGO6与RNA聚合酶II的一个亚基RPB2（由POLR2B基因编码）具有强相互作用。免疫共沉淀实验也证实了二者之间可相互作用,并且在tango6突变体中Rpb2的表达量降低。同时,我们发现当Rpb2的表达量降低后,细胞增殖水平及NSPCs细胞数目显著减少。然而,令我们意外的是,当我们在tango6突变体中回补polr2b m RNA时,不能拯救突变体NSPCs细胞增殖减少的表型。已有的研究表明,RPB2在核内参与基因的转录。因此,我们猜测TANGO6可能影响RPB2的正确定位。当我们回补NLS-polr2b m RNA时,tango6突变体神经元细胞数目减少及增殖缺陷的表型得到了显著改善,表明在tango6突变体中Rpb2减少是导致NSPCs细胞增殖缺陷的重要原因。在tango6突变体中P53激活和Rpb2的表达量降低都会抑制NSPCs细胞的增殖。研究表明当存在转录应激时P53被激活。因此我们推测在tango6突变体中P53的激活可能是由于Rpb2缺陷导致的。我们在HEK293T细胞系中敲降RPB2,发现P53及磷酸化P53蛋白水平显著增加,进一步研究发现,敲降RPB2后P53主要积累在细胞核内。在斑马鱼中经检测也发现Rpb2缺失可激活P53,这些结果都表明在tango6突变体中P53的激活是由于Rpb2缺失导致的。为了探究RPB2缺失激活P53的分子机制及二者之间调控的生理意义。我们做了免疫共沉淀实验,结果表明RPB2可以与P53蛋白相互作用。为了进一步阐明二者之间的关系,我们在细胞系中分别敲降及过表达P53后检测RPB2的表达水平,结果发现RPB2的表达水平随P53表达量的高低相应增加或减少,表明P53能够调控RPB2的表达。在polr2b突变体中,P53表达量显著提高。这些实验结果提示RPB2具有抑制P53活性的作用。Western bolt及免疫荧光染色实验结果表明,过表达RPB2后P53及磷酸化P53表达水平明显降低。同样的,在斑马鱼胚胎中检测也得到了类似的实验结果。众所周知,P53具有显著抑制细胞增殖的作用,因此其表达必须受到严格调控,从而避免对细胞的正常生理活动产生影响。MDM2是经典的P53抑制因子,通过泛素-蛋白酶体途径降解P53。为了检测RPB2抑制P53是否依赖于MDM2,我们在细胞中过表达RPB2,检测发现MDM2的蛋白水平没有明显变化,说明RPB2对P53的抑制作用不是通过上调MDM2的表达介导的。综上所述,我们发现在斑马鱼中tango6基因在NSPCs细胞中富集表达,并且以细胞自主性的方式调控神经元细胞的增殖,该过程可能是通过促进Rpb2的核定位实现的。同时,我们还发现P53与RPB2之间可形成反馈回路,P53促进RPB2的表达,RPB2反过来又会抑制P53的活性,并且这种抑制作用不依赖于上调MDM2的表达。当tango6基因突变后细胞中Rpb2的表达量减少,其对P53的抑制能力减弱,使得P53激活后在细胞内大量积累,进而抑制NSPCs细胞增殖,使其增殖分化产生的细胞减少。通过本实验的探究,我们对于tango6及Rpb2在神经细胞发育过程中的生物学功能有了全新的认识,tango6可能是治疗神经退行性疾病的重要靶点。