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人中性粒细胞载脂蛋白(Human neutrophil lipocalin,HNL),又称中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(Neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL),是由198个氨基酸组成的分泌型糖蛋白。它以单体、同二聚体及异二聚体等多种分子形式存在。不同分子形式HNL/NGAL可能来源不同,它们的功能也可能存在差异。HNL/NGAL能抑制细菌生长,调节细胞的分化与凋亡,以及参与肿瘤、肾损伤、急性感染等病理过程。HNL/NGAL是一具有临床应用潜力的疾病生物标志物。大量研究表明HNL/NGAL可用于早期预判急性肾损伤,也可以区分急性细菌和病毒感染。但是来自不同课题组或不同研究队列的研究数据显示HNL/NGAL在诊断相关疾病时的临床表现存在显著差异。课题组前期研究发现定量方法对HNL/NGAL临床表现产生显著影响。究其原因可能是因为临床样本中HNL/NGAL以多种分子形式存在,而目前HNL/NGAL定量方法缺乏分子形式特异性,这导致所定量的HNL/NGAL存在不确定性。因此,本论文尝试建立分子形式特异性的HNL/NGAL定量方法。主要进行了以下研究工作。1、制备分子形式特异性的HNL/NGAL单克隆抗体。首先,本论文分别利用大肠杆菌和杆状病毒-昆虫细胞表达系统表达HNL/NGAL,并通过亲和层析和凝胶过滤层析对HNL/NGAL进行分离纯化,获得单体和同二聚体HNL/NGAL。这为后续动物免疫和抗体鉴定提供抗原,也为构建HNL/NGAL定量方法提供标准蛋白。接着,用单体、同二聚体HNL/NGAL或两者的混合物免疫BALB/c小鼠,制备HNL/NGAL单克隆抗体,最终筛选到8株抗体。随后,我们采用Western-blotting和非竞争ELISA对制备的抗体与不同分子形式HNL/NGAL的识别特异性及亲和力进行了表征。其中1C5E5G3、2H8G11E7及4E9B10G4主要识别单体HNL/NGAL,其对单体HNL/NGAL亲和常数分别为1.8×10~8、3.8×10~7和4.2×10~8,对同二聚体HNL/NGAL亲和常数分别为2.8×10~7、1.5×10~7和1.8×10~8;7D10G3C4、8E7F5E3和9C6C7G8主要识别同二聚体HNL/NGAL,其对单体HNL/NGAL亲和常数分别为1.3×10~8、8.6×10~7和5.5×10~8,对同二聚体HNL/NGAL亲和常数分别为6×10~8、2.3×10~8和1.1×10~9;5D10G5E4、8E8D8D6对单体和同二聚体HNL/NGAL均能识别,它们对单体HNL/NGAL亲和常数分别为7×10~8、2.8×10~8,对同二聚体HNL/NGAL亲和常数分别为5.6×10~8、2.4×10~8。今后,我们将对上述抗体所识别的表位进行详细的鉴定。这部分研究结果为建立各种基于抗原-抗体反应的分子形式特异性的HNL/NGAL免疫学定量方法提供了可能。2、建立基于表面增强拉曼光谱(Surface-Enhanced Raman Scattering,SERS)技术的分子形式特异性HNL/NGAL检测方法。融合拉曼技术和免疫反应的优点,以4-巯基苯甲酸(4-mercaptobenzoic acid、4-MBA)修饰的纳米银粒子为SERS活性基底,以拉曼频移为参数,首次构建了基于SERS的分子形式特异性HNL/NGAL检测方法。该方法对单体和同二聚体HNL/NGAL的最低检测限均为10 ng/mL。我们今后将对耦合抗体的选择、报告分子4-MBA的浓度、反应条件等参数进行优化,以期克服目前该方法线性范围窄(10 ng/mL~40 ng/mL)、批间差异大(CV%=32%)等显著不足。这部分研究实现了单体和同二聚体HNL/NGAL的同步检测,丰富了HNL/NGAL快速检测技术。综上,本论文制备了单体和同二聚体HNL/NGAL,获得了分子形式特异性的抗HNL/NGAL单克隆抗体,初步建立了基于SERS的同步检测单体和同二聚体HNL/NGAL技术。这些研究有助于推动建立分子形式特异性HNL/NGAL检测方法,从而提高HNL/NGAL作为生物标志物诊断相关疾病的精确度,进而促进HNL/NGAL的临床应用。