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第一部分DOCK5-/-小鼠的引进、繁育及子代基因型鉴定目的:获取DOCK5敲除模型小鼠并顺利繁殖和鉴定,为深入研究DOCK5基因的功能奠定基础。方法:联系加大拿蒙特利尔临床研究所(IRCM)细胞骨架的组织和细胞迁移研究室并同意惠赠DOCK5敲除模型小鼠,委托国内专业科研单位代理小鼠的进口事务并将小鼠运输至本单位动物实验中心喂养和繁殖,并观察小鼠繁殖情况及表型变化。根据孟德尔遗传定律进行繁殖得到不同基因型的子代小鼠,利用PCR技术对子代小鼠进行基因型鉴定。结果:引进DOCK5+/-小鼠6只,小鼠繁殖及生育顺利,符合孟德尔遗传定律。探索得到适宜的DOCK5鉴定PCR扩增条件,顺利进行DOCK5敲除小鼠的基因型鉴定。结论:DOCK5敲除小鼠引进、饲养及繁殖顺利,成功建立敲除鼠的鉴定PCR技术,能够得到来源稳定的动物模型,可用于后续的相关研究。第二部分DOCK5对糖代谢影响的体内研究目的:探讨高脂饮食诱导下DOCK5敲除对小鼠胰岛素抵抗及糖代谢的影响。方法:以C57BL/6J背景的DOCK5+/+小鼠和DOCK5-/-小鼠为研究对象,随机分为4组:DOCK5+/+小鼠普通饲料喂养组(SD-DOCK5+/+组,n=30)、DOCK5+/+小鼠高脂饲料喂养组(HFD-DOCK5+/+组,n=30)、DOCK5-/-小鼠普通饲料喂养组(SD-DOCK5-/-组,n=30)、DOCK5-/-小鼠高脂饲料喂养组(HFD-DOCK5-/-组,n=30)。利用高脂饮食和基因敲出构建环境与遗传双重因素作用的动物模型,观察各组小鼠体重、摄食、呼吸商和能量消耗的变化,测定其血糖、胰岛素和血脂等生化指标,行葡萄糖耐量试验、胰岛素耐量试验、丙酮酸耐量试验以及高胰岛素正糖钳夹和组织糖摄取等实验,评价机体总体代谢情况、葡萄糖代谢以及胰岛素敏感性的变化。结果:成功构建遗传与环境因素相互作用的动物模型。与SD-DOCK5+/+组小鼠相比,SD-DOCK5-/-组小鼠各个指标没有显著性变化(P>0.05);HFD-DOCK5+/+组小鼠各个指标呈现出高脂饮食诱导后出现的相应变化。与HFD-DOCK5+/+组小鼠相比,HFD-DOCK5-/-组小鼠体重、肝重、附睾脂肪重量显著增高(P<0.05);摄食增加,而呼吸商及能量消耗显著下降(P<0.01);基础态血糖、胰岛素、血脂水平显著升高(P<0.01或P<0.05)。GTT、ITT和PTT结果显示HFD-DOCK5-/-组小鼠在负荷状态下血糖或胰岛素水平均显著高于HFD-DOCK5+/+组小鼠(P<0.01或P<0.05)。钳夹稳态时HFD-DOCK5-/-组小鼠GIR和GRd显著低于HFD-DOCK5+/+组小鼠(P<0.01或P<0.05),HGP显著增高,HGP抑制率显著下降(P<0.05)。组织糖摄取的结果显示,HFD-DOCK5-/-组小鼠肝脏和附睾脂肪的组织糖摄取显著低于HFD-DOCK5+/+组小鼠(P<0.01),但是两组小鼠间骨骼肌肉组织的糖摄取没有变化。结论:高脂饮食诱导下DOCK5敲除可导致小鼠胰岛素抵抗和葡萄糖代谢障碍,与2型糖尿病的发生存在密切的联系。第三部分DOCK5调控肝脏糖代谢的分子机制研究目的:观察DOCK5敲除或抑制表达对肝脏PI3K-Akt途径及相关糖代谢关键信号分子的影响,探讨DOCK5参与胰岛素抵抗及葡萄糖代谢紊乱的分子机制。方法:利用QPCR技术分析C57BL/6J小鼠DOCK5 m RNA的组织表达分布。检测SD-DOCK5+/+组和HFD-DOCK5-/-组小鼠肝脏、肌肉、脂肪DOCK5m RNA和蛋白表达变化。在各组小鼠肝脏组织中检测IR、IRS1、Akt、GSK3β、PEPCK、G6Pase和PP2A蛋白表达或活性变化。利用DOCK5-sh RNA质粒转染Hepa1-6肝细胞构建DOCK5抑制表达的细胞模型,并在胰岛素刺激和/或PP2A抑制剂OKadaic acid处理的情况下检测细胞的葡萄糖摄取率变化,分析DOCK5抑制表达对IR、IRS1、Akt、GSK3β、PEPCK和G6Pase蛋白的表达及活性变化,并分析OKadaic acid对上述相关指标的影响。结果:C57BL/6J小鼠DOCK5 m RNA在体内多种组织均有表达,肝脏的表达量高于脂肪和肌肉组织。DOCK5 m RNA和蛋白在HFD-DOCK5+/+组小鼠肝脏的表达量显著高于SD-DOCK5+/+组小鼠(P<0.01),组间肌肉和脂肪组织的差异表达没有统计学意义。与SD-DOCK5+/+组小鼠相比,SD-DOCK5-/-组小鼠肝脏IR、IRS1、Akt、GSK3β、PEPCK、G6Pase和PP2A蛋白表达或活性变化没有差异(P>0.05);HFD-DOCK5+/+组小鼠肝脏各个指标呈现出高脂饮食诱导后的相应变化(P<0.05)。与HFD-DOCK5+/+组小鼠相比,HFD-DOCK5-/-组小鼠肝脏IR和IRS1蛋白磷酸化水平没有差异,Akt、GSK3β和PP2A蛋白磷酸化水平显著下降(P<0.05),而PEPCK和G6Pase蛋白表达增高(P<0.05)。Hepa1-6肝细胞模型中DOCK5抑制表达可显著降低胰岛素刺激的细胞葡萄糖摄取(P<0.01),PP2A抑制剂可以逆转这种效应。DOCK5抑制表达可显著降低PP2A蛋白磷酸化水平(P<0.01),但不影响IR和IRS1蛋白磷酸化水平。DOCK5抑制表达可降低Hepa1-6肝细胞胰岛素刺激引起的Akt、GSK3β蛋白磷酸化水平(P<0.05),显著增加PEPCK和G6Pase蛋白表达量(P<0.01),给予PP2A抑制剂干预后相应指标的变化无统计学意义(P>0.05)。结论:DOCK5可能通过PI3K-Akt途径发挥对胰岛素信号转导和葡萄糖代谢的调控,PP2A可能是DOCK5与葡萄糖代谢途径发生交互作用的关键因子。