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目的1.构建二乙基亚硝胺（Diethylnitrosamine,DEN）诱导小鼠肝纤维化-肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）动态模型,模拟肝纤维化-肝细胞癌发生发展过程。2.观察丹酚酸B（Salvianolic acid B,Sal B）对DEN诱导小鼠肝纤维化-HCC进程的影响。3.初步探讨Sal B经由pSmad3C/p21介导的抑制肝纤维化-肝癌信号、pSmd3L/PAI-1/c-Myc介导的促肝纤维化-肝癌信号转换机制。4.观察 Sal B 对转化生长因子-β1（Transforming grow factor beta 1,TGF-β1）诱导的HSC-T6细胞移行能力的影响,并初步分析在HSC-T6细胞中Sal B如何调控pSmad3C/p21 与 pSmad3L/PAI-1/c-Myc 信号转换。方法1.建立动物模型,观察Sal B对肝纤维化-HCC病变进程的影响。100只雄性昆明种小鼠,随机分成5组:正常对照组、模型组、不同剂量SalB(15,30 mg·kg-1)组、阳性药物秋水仙碱(0.2 mg·kg-1)组,每组20只。除正常对照组外,其余组根据小鼠体质量10 mL·kg-1腹腔注射1.0%DEN溶液（连续16周,1次/周）诱导肝纤维化-HCC模型,对照组给予相应溶媒。于造模当天开始,Sal B组小鼠分别给予15、30mg·kg-1·d-1 Sal B灌胃,阳性药物组给予0.2mg·kg-1·d-1秋水仙碱灌胃,正常对照组给予相应溶媒灌胃,持续给药至16周末。于造模第12、16周结束时分批处死小鼠,肝脏活检,苏木精-伊红（HE）染色、Van Gieson（VG）染色评估肝组织病理学特征。2.通过细胞划痕实验,观察Sal B对HSC-T6细胞移行能力的影响。实验分组:对照组,TGF-β1（60 pmol·L-1）刺激组,Sal B（25,50,100 umol·L-1）+TGF-β1（60 pmol·L-1）组。取HSC-T6对数生长期细胞,调整细胞密度为5.0×106 ml-1接种于6孔板中,待细胞生长面单层铺满后,更换无血清培养基饥饿2 h,划痕,于TGF-p1刺激组加入60pmol·L-1 TGF-βi,Sal B干预组分别加入Sal B（25,50,100 μmol·L-1）和60pmol·L-1 TGF-β1,对照组加入等体积溶媒,分别于划痕0h、12 h、24 h后倒置光学显微镜下摄片。3.Western blot 法检测肝组织和 HSC-T6 细胞中 pSmad3C,pSmad3L,p21,PAI-1和c-Myc表达常规方法提取小鼠肝组织细胞或HSC-T6中的总蛋白,分别采用兔抗pSmad3C、兔抗pSmad3L、小鼠抗p21、兔抗PAI-1、兔抗c-Myc和兔或小鼠抗GAPDH抗体检测 pSmad3C,pSmad3L,p21,PAI-1 和 c-Myc 表达。结果1.Sal B改善DEN诱导的肝纤维化-HCC小鼠的一般状况DEN诱导的肝纤维化-HCC小鼠12周后,与正常组比较,模型组小鼠出现皮毛枯槁无光泽、食欲不振、活动减少等表现,体重逐渐减轻;和模型组比较,Sal B组症状改善,食欲增加,精神状况较好。2.Sal B对DEN诱导的小鼠肝纤维化期的影响2.1 Sal B对小鼠体质量、肝重与肝脏系数的无显著影响与正常组相比,12周末时,模型组小鼠体质量、肝重与肝脏系数明显降低;与模型组比较,Sal B组小鼠体质量与肝重有增加的趋势,肝脏系数无明显变化。2.2 Sal B改善小鼠肝纤维化病变与正常组相比,12周末模型组小鼠肝脏表面粗糙,边缘变钝,肝组织炎性细胞浸润,胶原纤维增生,大量胶原纤维分隔肝小叶结构形成假小叶结构;与模型组比较,SalB组小鼠肝脏表面较光滑,质地较柔软,肝组织胶原纤维增生轻于模型组,未形成假小叶结构,Sal B组小鼠病变程度减轻。2.3 SalB对DEN诱导的肝纤维化小鼠肝组织中pSmad3C,pSmad3L,p21和PAI-1表达的影响12周时,与正常组相比,模型组pSmad3L,PAI-1,p21表达量明显升高,pSmad3C表达无显著变化:与模型组比较,SalB组pSmad3L与PAI-1表达显著减少,pSmad3C和p21表达明显增加。3.Sal B对DEN诱导的小鼠HCC癌前病变的影响3.1 Sal B增加小鼠体质量、肝重与肝脏系数16周末时,与正常组相比,模型组小鼠体质量、肝重与肝脏系数明显减少;与模型组比较,Sal B组小鼠体质量、肝重与肝脏系数增加,差异均具有统计学意义。3.2 Sal B改善小鼠肝脏HCC癌前病变16周末时,模型组肝脏出现大量弥漫性结节,质地坚硬,肝小叶结构紊乱,肝细胞核体积变大,染色变深,分裂相增多;与模型组比较,Sal B组小鼠肝脏结节少,质地较柔软,细胞核异型性均轻于模型组。3.3 Sal B对DEN诱导的HCC癌前病变期小鼠肝组织中pSmad3C,pSmad3L,p21,PAI-1和c-Myc表达的影响16周时,与正常组相比,模型组小鼠肝组织中pSmad3C、p21表达增加,pSmad3L、PAI-1和c-Myc蛋白水平显著升高;与模型组比较,Sal B组pSmad3L、PAI-1和c-Myc表达明显减低,pSmad3C表达量增加,p21蛋白水平无显著变化。4.Sal B抑制TGF-β1诱导的HSC-T6细胞移行在HSC-T6细胞中,与对照组比较,随着TGF-β1刺激时间的延长,TGF-β1刺激组划痕伤口宽度逐渐变窄,而与TGF-β1刺激组相比,SalB干预组伤口愈合速度缓慢,伤口宽度较宽。5.Sal B 对 TGF-β1诱导的 HSC-T6细胞内 pSmad3C、pSmad3L、PAI-1 和 p21 表达的影响在HSC-T6细胞中,与TGF-β1刺激组比较,Sal B干预组pSmad3C和p21表达显著增加,而pSmad3L和PAI-1表达明显降低。结论1.DEN诱导小鼠肝纤维化-HCC 12周时为纤维化病变期,16周时为HCC癌前病变期。2.Sal B延缓DEN诱导的小鼠肝纤维化-HCC发展进程。3.Sal B抑制TGF-β1诱导的HSC-T6细胞移行,发挥抗肝纤维化的作用。4.Sal B延缓肝纤维-HCC发生发展可能与调控pSmad3C/p21和pSmad3L/PAI-1/c-Myc 信号转换有关。