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多种眼部疾病的重要的致病原因为眼内病理性新生血管生成,抑制病理性新生血管生成是一个有效的治疗眼部诸多病理性新生血管性疾病的方法。与血管生成关系密切的细胞生长因子例如血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)等都有促进血管内皮细胞增殖并促进病理性新生血管进展的作用。寻找途径抑制这些生长因子的作用就可以在一定程度上有效地减缓病理性新生血管的发展。我们课题组以往的研究结果发现,Gαi蛋白在血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)等细胞因子活化下游AKT-mTOR和MAPK/ERK等信号通路中发挥重要作用。MYDGF是骨髓源性的血管生长因子,既往研究已经证实其在机体各组织器官中都有不同程度的表达,并且有较强的促进血管内皮细胞增殖和存活的作用,本课题主要探讨Gαi是否在MYDGF介导的新生血管形成过程中发挥着重要作用,希望能为治疗眼内病理性新生血管性疾病提供一个新的思路。研究目的?解析Gαi介导MYDGF信号转导的分子机制;?明确MYDGF及Gαi表达量对于血管生成的作用。研究方法?培养野生型小鼠胚胎成纤维细胞(WT-MEFs),Gαi1和Gαi3双敲除的小鼠胚胎成纤维细胞(DKO-MEFs),Gαi1单敲除的小鼠胚胎成纤维细胞(Gαi1KO-MEFs),Gαi2单敲除的小鼠胚胎成纤维细胞(Gαi2KO-MEFs),Gαi3单敲除的小鼠胚胎成纤维细胞(Gαi3KO-MEFs)以及Gab1敲除的小鼠胚胎成纤维细胞(Gab1KO-MEFs);?运用shRNA方法靶向敲减MEFs中的Gαi1蛋白和Gαi3蛋白(shRNA-MEFs);?在Gαi1和Gαi3双敲除的小鼠胚胎成纤维细胞(DKO-MEFs)中重新导入外源性Gαi1和Gαi3的表达质粒以获得Rescue1-MEFs和Rescue3-MEFs;?分别用不同浓度MYDGF处理上述细胞不同时间后,检测与AKT-mTOR及MAPK/ERK信号通路相关的Akt、S6、S6K、GSK3α/3β和Erk等标志性蛋白的活化水平;?用靶向敲低Gαi1和Gαi3基因的慢病毒载体转染HUVEC细胞后获得Gαi1/3-shRNA HUVEC细胞,并在HUVEC细胞中转染阴性病毒获得scr-shRNA HUVEC细胞;?用持续通入高浓度氧气的方法诱导建立小鼠早产儿视网膜病变模型(ROP),取成型小鼠视网膜组织检测其MYDGF含量;?检测增殖性糖尿病视网膜病变(PDR)病人的视网膜增殖膜中MYDGF的含量。结果?在MEFs细胞中,双敲Gαi1和Gαi3阻断了MYDGF诱导的AKT-mTOR及MAPK/ERK信号通路的活化;?Gαi1KO-MEFs、Gαi3KO-MEFs和shRNA-MEFs在MYDGF作用下,其下游信号活化水平都有不同程度的降低,而Gαi2KO-MEFs在MYDGF处理后,下游信号未发生显著变化;?在MYDGF作用下Rescue1-MEFs和Rescue3-MEFs下游的信号活化水平有明显的恢复;?Gab1KO-MEFs在MYDGF作用下,表现出下游AKT-mTOR信号通路和MAPK/ERK信号通路活化水平的大幅降低甚至缺失;?在MYDGF的作用下,HUVEC细胞的迁移、成管、增殖等细胞活动增强,而转染Gαi1/3-shRNA慢病毒后的HUVEC细胞的上述细胞活动情况受到明显抑制;?ROP成型的小鼠视网膜组织中的MYDGF的含量较对照组小鼠视网膜中的MYDGF含量明显升高;?增殖性糖尿病性视网膜病变的病人视网膜组织中MYDGF含量明显高于对照组视网膜组织中的MYDGF含量。结论?体外实验结果提示Gαi1/3可能介导MYDGF诱导的下游信号转导;?细胞行为学和功能学实验结果表明Gαi1/3在MYDGF促HUVEC增殖过程中发挥着重要的作用;?在体实验表明MYDGF在多种血管生成增多的疾病中表达增加。