前言：　　 阿尔茨海默病(Alzheimersdisease,AD)是一种慢性的神经系统变性病,是老年人进行性记忆障碍和认知功能障碍的最常见的原因。目前,AD的原因不清楚,也没有满意的治疗方法。AD的神经病理表现在大体病理呈弥漫性脑萎缩,镜下病理包括老年斑(SP)、神经元纤维缠结(NFT)和脑内的神经元缺失。老年斑的主要成分是β淀粉样蛋白(Aβ),Aβ肽由淀粉样前体蛋白(APP)经过β和γ分泌酶酶解产生。AD病因学的著名假说是淀粉样蛋白瀑布假说,该学说认为Aβ的异常聚集在AD的起病及进展中起到核心作用。清除聚集的Aβ和/或阻止Aβ的形成和聚集可能成为有效的抗AD的治疗策略。　　 免疫治疗可能是最有希望阻止和清除Aβ聚集的方法之一。研究表明,用Aβ42肽免疫AD模型鼠时能够产生高滴度的抗Aβ抗体,减少鼠脑内Aβ的沉积,并能使鼠的学习和记忆功能得到改善。Aβ疫苗(AN1792)在Ⅱ期临床试验时,因为6%的病人出现了无菌性脑膜脑炎而被迫停止。随后的研究认为无菌性脑膜脑炎由T细胞介导的自身免疫反应(Th1型免疫反应)引起,与抗体无关。而且Th1型免疫佐剂组合的选择,包括皂角素(QS-21)和聚山梨醇酯80,加剧了Th1型免疫反应。尽管这些病人没有接受全程的主动免疫,仍然有60%病人产生抗Aβ抗体,产生高滴度(20%)抗体的病人的认知功能减退的速度明显下降。对免疫病人的随访研究发现Aβ42免疫能清除病人脑内的Aβ沉积。　　 被动免疫研究用抗Aβ抗体免疫APP转基因鼠能减少鼠的老年斑沉积并改善行为学。目前正在进行着多个人源性单克隆抗Aβ抗体的临床试验。但是被动免疫也有其缺陷,如需反复注射,成本昂贵,需要足够的血脑屏障渗透能力及出血的危险等。所以仍然需要寻找安全有效的AD免疫治疗策略。研究认为主要诱导Th2型免疫反应的免疫方式对于AD的预防和治疗是安全的。为了建立一种能产生Th2型免疫反应的安全AD免疫,研究者进行了一些实验性免疫策略的探索,包括选择Aβ的B细胞表位比如Aβ1-15,免疫佐剂修饰,改变免疫途径及疫苗运送机制等。同时一些研究表明编码Aβ的DNA疫苗免疫小鼠可以产生特异性的抗Aβ抗体,产生B细胞免疫反应,却不发生有害的T细胞介导的免疫反应。　　 在本研究中,我们构建了DNA疫苗p(Aβ3-10)10-mIL-4,编码重复10次的Aβ3-10并且融入小鼠白细胞介素4(IL-4)作为基因佐剂。我们选择Aβ3-10是因为Aβ1-15已经被确认是B细胞表位。为了克服Aβ3-10肽段小免疫原性弱,我们编码了重复10次的Aβ3-10片段作为目的基因。而且选择Th2型细胞因子IL-4作为佐剂加到(Aβ3-10)10以进一步增强其免疫原性。在本研究中,我们构建了DNA疫苗p(Aβ3-10)10-mlL-4,并进一步探讨其作为AD疫苗的安全性及免疫效果。　　 实验方法：　　 人工合成重复10次的Aβ-10片段(Aβ3-10)10,克隆入真核表达质粒pcDNA3.1(+)-mIL-4中,酶切位点为HindⅢ和EcoRⅠ。重组质粒结构:HindⅢkozaksequence-(Aβ3-10)10-GGGGSlinker-BamHI-IL4一EcoRI。质粒转化大肠杆菌DH5α扩增并大量提取。重组质粒经琼脂糖凝胶电泳及测序鉴定。脂质体方法将质粒转染HEK293细胞。用Westernblotting方法检测表达产物。将重组质粒p(Aβ3-10)10-mIL-4用电穿孔的方法肌肉注射免疫BALB/c小鼠,Aβ42肽及pcDNA3.1(+)作为对照。ELISA的方法测定免疫后血清中的抗体滴度、抗体分型及体外脾细胞培养上清中的细胞因子。免疫组化的方法检测抗血清对APP/PS1转基因鼠脑Aβ斑的识别。用p(Aβ3-10)10-mIL-4免疫APP/PS1转基因鼠,ELISA的方法测定免疫后血清中的抗体滴度、抗体分型、体外脾细胞培养上清中的细胞因子及鼠血清和脑组织中的Aβ含量。水迷宫的方法检测转基因鼠的学习记忆能力。免疫组化的方法检测鼠脑内的老年斑、星形胶质细胞、小胶质细胞及鼠脑内的炎症反应。　　 实验结果：　　 一、质粒成功构建并转染HEK293细胞　　 重组质粒成功构建,经酶切及测序鉴定序列正确。成功转染HEK293细胞,表达融合蛋白。　　 二、重组质粒免疫BALB/e小鼠的免疫效果　　 1、血清抗体及分型测定重组质粒p(Aβ3-10)10-mIL-4组及Aβ42组免疫BALB/c小鼠后均产生了较高滴度的血清抗体,Aβ42组抗体滴度高于p(Aβ-10)10-mIL-4组,而pcDNA3.1(+)质粒组未产生抗Aβ抗体。P(Aβ3-10)10-mIL-4免疫BALB/c小鼠后产生的抗体以IgG1为主,p(Aβ3-10)10-mIL-4组IgG1/IgG2a比值约是Aβ42组的8倍。　　 2、重组质粒免疫后BALB/c小鼠脾细胞培养上清的细胞因子检测经相应抗原刺激后脾细胞培养上清中,Aβ42组及p(Aβ3-10)10-mIL-4组的IL-4的含量均明显高于pcDNA3.1(+)组。Aβ42组的IFN-γ的含量最高,明显高于P(Aβ3-10)10-mIL-4组及pcDNA3.1(+)组。　　 3、抗血清与APP/PS1转基因鼠脑内的老年斑相结合经免疫组织化学染色证实重组质粒p(Aβ3-10)10-mIL-4免疫BALB/c小鼠后产生的抗血清能与10月龄的APP/PS1转基因鼠脑内的老年斑相结合。　　 三、重组质粒免疫APP/PS1转基因鼠的免疫效果　　 1、血清抗体及分型测定ELISA结果:重组质粒P(Aβ-10)10-mIL-4组及Aβ42组免疫APP/PS1转基因鼠后均产生了较高滴度的抗Aβ抗体,Aβ42组抗体滴度高于p(Aβ3-10)10-mIL-4组,而pcDNA3.1(+)质粒组未产生抗Aβ抗体。P(Aβ3-1o)10-mIL-4组免疫后产生的抗体以IgG1为主,IgG1/IgG2c比值约是Aβ42组的8倍。　　 2、脾细胞培养上清的细胞因子检测　　 ELISA结果:经相应抗原刺激后脾细胞培养上清中,Aβ42组及p(Aβ3-10)10-mIL-4组的IL-4的含量均明显高于pcDNA3.1(+)组。Aβ42组的脾细胞培养上清中IFN-γ的含量最高,明显高于p(Aβ3-10)10-mIL-4组及pcDNA3.1(+)组。而P(Aβ3-10)10-mIL-4组和pcDNA3.1(+)组的脾细胞培养上清中IFN-γ的含量没有差别。　　 3、免疫接种对APP/PS1转基因鼠的学习记忆能力影响　　 Morris水迷宫实验:隐藏平台定位航行实验中,p(Aβ3-10)10-mIL-4组、Aβ42组及pcDNA3.1(+)组小鼠搜索平台的潜伏期呈逐渐下降趋势。P(Aβ3-10)10-mIL-4组及Aβ42组小鼠的逃避潜伏期明显低于pcDNA3.1(+)组。在探索实验中,1min内p(Aβ3-10)10-mIL-4组及Aβ42组小鼠经过平台位置的次数明显高于pcDNA3.1(+)组。表明p(Aβ3-10)10-mIL-4组及Aβ42组小鼠的空间学习和记忆能力得到改善。　　 4、脑组织及血清中可溶性Aβ42检测　　 ELISA结果显示:无论是在脑组织中还是血清中,p(Aβ3-10)10-mIL-4组及Aβ42组的可溶性Aβ42水平均明显高于pcDNA3.1(+)组,但两组之间无差异。　　 5、免疫后APP/PS1鼠脑内的老年斑、星形胶质细胞、小胶质细胞、淋巴细胞浸润及微出血的免疫组化结果　　 用免疫组化及定量分析方法。Aβ42组及p(Aβ3-10)10-mIL-4组,海马及皮层Aβ斑与pcDNA3.1(+)组相比明显减少。与老年斑结果一致,Aβ42组及p(Aβ3-10)10-mIL-4组海马及皮层的GFAP阳性细胞及Iba1阳性细胞与pcDNA3.1(+)组相比明显减少。P(Aβ3-10)10-mIL-4组与pcDNA3.1(+)组脑内无明显CD3或CD4阳性表达细胞。而Aβ42组脑组织中可见大量CD3和CD4阳性的细胞。说明p(Aβ3-10)10-mIL-4与pcDNA3.1(+)免疫小鼠脑内无明显淋巴细胞浸润,而Aβ42免疫小鼠脑内存在大量淋巴细胞浸润。HE染色中,3组转基因鼠脑组织均未见微出血。　　 结论：　　 1、表达(Aβ3-10)10及mIL-4融合蛋白DNA疫苗p(Aβ-10)10-mIL-4成功构建。　　 2、DNA疫苗p(Aβ3-10)10-mIL-4免疫BALB/c小鼠后能够产生高滴度的抗Aβ抗体,而且产生了Th2型免疫反应。　　 3、DNA疫苗p(Aβ1-10)10-mIL-4免疫APP/PS1转基因鼠可以改善APP/PS1转基因鼠的空间学习记忆的能力。　　 4、DNA疫苗p(Aβ3-10)10-mIL-4免疫APP/PS1转基因鼠可以产生较高滴度的抗Aβ抗体,产生了Th2型的免疫反应。　　 5、DNA疫苗p(Aβ3-10)10-mIL-4免疫APP/PS1转基因鼠可以减少转基因鼠脑内皮层及海马区的老年斑数量,同时减少小胶质细胞及星形胶质细胞的数量,脑内无明显T淋巴细胞浸润,无微出血。