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叶枕是处于叶片和叶鞘之间的机械组织,包括叶枕带、叶耳、叶舌。叶枕的有无和发育程度直接影响了叶夹角的大小,从而影响水稻株型和产量。但是,叶枕起始和发育过程的调控机制尚不清楚。本研究通过对水稻叶枕起始关键基因进行鉴定和突变体分析,探究了叶枕的起始机制。同时,也对叶枕发育过程中的细胞学结构和基因表达动态变化进行了分析,鉴定了参与叶枕发育过程的特异基因,并验证了参与叶枕发育的重要转录因子的功能。结果如下:
首先,利用玉米LG2基因的蛋白序列在蛋白数据库中进行同源比对,鉴定到两个水同源基因OsLG2、OsLG2L;通过体式镜和扫描电镜观察基因缺失突变体的叶枕部位确定了LG1和LG2基因在叶枕的起始过程中的功能;荧光定量PCR及GUS组织染色结果证明OsLG1、OsLG2、OsLG2L在叶枕中特异表达,并且OsLG2和OsLG2L在叶枕起始过程中先于OsLG1表达;亚细胞定位观察和双分子荧光互补(BIFC)实验揭示了OsLG1、OsLG2和OsLG2L均定位在细胞核中,OsLG2与OsLG2L可以形成异源二聚体,OsLG2还可与OsLG1在核中互作;顺式调控元件分析发现,OsLG1、OsLG2、OsLG2L的基因启动子区域存在许多属于HD-ZIP家族以及KANADI、RAMOSA1等转录因子的结合位点(TFBS);RNA-seq数据分析,发现与器官起始、分界区域形成相关基因,以及不同类型转录因子在突变体中具有显著表达变化;通过叶枕起始阶段相比叶片的特异基因,以及oslg1和oslg2/oslg2l下调基因,提出了叶枕起始的转录调控机制。叶枕的细胞学结构和机械强度决定了叶夹角大小。我们根据水稻第一完全叶的形态学和细胞学结构与观察,鉴定了水稻第一叶叶枕发育的五个连续并完整的发育阶段,并对每个时期的叶枕和叶片样品进行RNA-seq和小RNA(sRNA)测序;在转录组数据分析中,本文针对叶枕发育过程,根据时期表达特征,对基因及小RNA中的microRNA(miRNA)进行了聚类,分别获得了23个和20个基因和miRNAs的表达趋势类型,并通过功能富集分析推测影响叶枕细胞学结构变化的关键生物学过程;针对叶枕和叶片的组织发育差异性,鉴定到在叶枕中表达特异的基因和miRNAs集合,可作为叶枕不同发育时期的标记基因;通过启动予分析对具有时期特异表达特征的多个基因集合、miRNA集合进行了共调控预测,获得了60个调控叶枕发育过程的重要转录因子,利用CRISPR/CAS9技术创制了相关缺失突变体,通过表型观察、石蜡切片、徒手切片、实时荧光定量PCR和CHIP-qPCR等实验验证了它们对叶枕发育的调控作用,为叶枕发育和叶夹角形成的调控网络建立奠定了基础。
首先,利用玉米LG2基因的蛋白序列在蛋白数据库中进行同源比对,鉴定到两个水同源基因OsLG2、OsLG2L;通过体式镜和扫描电镜观察基因缺失突变体的叶枕部位确定了LG1和LG2基因在叶枕的起始过程中的功能;荧光定量PCR及GUS组织染色结果证明OsLG1、OsLG2、OsLG2L在叶枕中特异表达,并且OsLG2和OsLG2L在叶枕起始过程中先于OsLG1表达;亚细胞定位观察和双分子荧光互补(BIFC)实验揭示了OsLG1、OsLG2和OsLG2L均定位在细胞核中,OsLG2与OsLG2L可以形成异源二聚体,OsLG2还可与OsLG1在核中互作;顺式调控元件分析发现,OsLG1、OsLG2、OsLG2L的基因启动子区域存在许多属于HD-ZIP家族以及KANADI、RAMOSA1等转录因子的结合位点(TFBS);RNA-seq数据分析,发现与器官起始、分界区域形成相关基因,以及不同类型转录因子在突变体中具有显著表达变化;通过叶枕起始阶段相比叶片的特异基因,以及oslg1和oslg2/oslg2l下调基因,提出了叶枕起始的转录调控机制。叶枕的细胞学结构和机械强度决定了叶夹角大小。我们根据水稻第一完全叶的形态学和细胞学结构与观察,鉴定了水稻第一叶叶枕发育的五个连续并完整的发育阶段,并对每个时期的叶枕和叶片样品进行RNA-seq和小RNA(sRNA)测序;在转录组数据分析中,本文针对叶枕发育过程,根据时期表达特征,对基因及小RNA中的microRNA(miRNA)进行了聚类,分别获得了23个和20个基因和miRNAs的表达趋势类型,并通过功能富集分析推测影响叶枕细胞学结构变化的关键生物学过程;针对叶枕和叶片的组织发育差异性,鉴定到在叶枕中表达特异的基因和miRNAs集合,可作为叶枕不同发育时期的标记基因;通过启动予分析对具有时期特异表达特征的多个基因集合、miRNA集合进行了共调控预测,获得了60个调控叶枕发育过程的重要转录因子,利用CRISPR/CAS9技术创制了相关缺失突变体,通过表型观察、石蜡切片、徒手切片、实时荧光定量PCR和CHIP-qPCR等实验验证了它们对叶枕发育的调控作用,为叶枕发育和叶夹角形成的调控网络建立奠定了基础。