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研究目的通过Sepsis-AKI动物模型和细胞模型的建立,研究Sepsis-AKI大鼠和LPS诱导的人近端小管上皮细胞HK-2不同时间点miR-30a、miR-30e及其相关成熟体(miR-30a-3p,miR-30e-3p)的表达情况,探索miR-30s的表达与炎症反应的关系;预测和验证miR-30a-3p的靶基因,探讨miR-30a-3p在Sepsis-AKI中发挥的作用及其机制。研究方法取体态健康、活动正常的Sprague Dawley(SD)大鼠用于动物实验,随机分为正常对照组(0h)、CLP(cecal ligation puncture,盲肠结扎穿孔法)术后3h、6h、12h、24h四个时相亚组,每组各6只,最终共30只有效样本纳入实验;使用LPS(lipopolysaccharide,脂多糖)刺激HK-2细胞建立细胞模型,细胞实验大体上分为7组:空白对照组(0h组)及LPS(10ug/ml)处理0.5h、1h、3h、6h、12h、24h组,每组样本量n=3。采用RT-qPCR技术对各组miRNA-30a和miRNA-30e与相关成熟体进行定量分析,采用ELISA技术及RT-qPCR技术对炎症因子TNF-α、IL-1β和IL6进行检测和分析,研究miR-30a和miR-30e及其相关成熟体与炎症因子产生的相关性。生物信息学方法和western blot技术预测和验证miR-30a-3p靶基因和靶位点,探讨miR-30a-3p在Sepsis-AKI中发挥的作用及其机制。通过miRWalk,TargetScan,miRDB,mirDIP四个miRNA靶标分析数据库检索hsa-miR-30a-3p可能的靶基因并将多个数据库的预测结果取交集作为最终候选靶基因;通过RNA hybrid数据库和Targetscan数据库预测miRNA-30a-3p与TEAD1 3’UTR可能结合位点信息;HK-2细胞转染实验分为四组:LPS+NCm组、LPS+NCi组、LPS+miR-30a-3p mimics组及LPS+miR-30a-3p inhibitor组,转染后36h给予LPS终浓度l0ug/ml刺激,48h后收集细胞qPCR验证转染效率;60h后收集细胞沉淀Western Blot检测靶蛋白TEAD1的表达。研究结果1、Sepsis-AKI大鼠模型建立后的一般表现,腹腔感染,肾组织的病理改变及肾损伤标志物的表达。CLP模型组大鼠术后精神萎靡,发热,呼吸急促,畏寒、颤抖,毛发竖立,活动迟缓,不思食水,双眼分泌物较多。术后24h,肠管水肿明显加重,粘膜充血,腹水渗出明显增多,感染特征明显。随着术后时间延长,大鼠腹腔感染加重,肠管水肿、腹水渗出愈发严重。肾组织石蜡切片HE染色发现:CLP组肾小管上皮细胞肿胀,肾小管扩张,管状结构破坏,上皮细胞肾间质水肿,肾小球毛细血管扩张、充血。并且随着时间延长,病理改变越明显。大鼠造模后不同时间组血清肌酐值各组与对照组比较皆有上升,其中6h、12h、24h与对照组比较有统计学差异(分别为P=0.0054,P=0.0001,P=0.0001);血清尿素值从造模后3h开始逐渐升高,24h后明显升高,与对照组比较具有统计学意义(P=0.0343)。2、Sepsis-AKI大鼠肾脏组织miRNA-30a-3p、miRNA-30a-5p、miRNA-30e-3p、miRNA-30a-5p及炎症因子表达改变与二者的相关性。大鼠术后3h炎症因子TNF-a和IL-1β的表达皆明显上升P<0.05.(TNF-a:P=0.0157,IL-1β:P=0.0224)而炎症因子爆发上调6h以后迅速回落。术后miR-30e-3p和miR-30a-3p在12h表达明显下调(P<0.05)而后继续下降;而miR-30e-5p和miR-30a-5p在术后3h表达量即开始明显下调(P<0.05),且随着术后时间延长持续降低。在Sepsis-AKI大鼠模型中除了miR-30e-3p和IL-1β的表达呈正相关(r=0.44,P<0.05);其余各组结果没有统计学意义,二者没有明显相关性。3、LPS刺激HK-2细胞后miRNA-30a-3p、miRNA-30a-5p、miRNA-30e-3p、miRNA-30a-5p及炎症因子表达改变与二者的相关性。miR-30e-3p和miR-30a-3p、miR-30e-5p、miR-30a-5p在LPS处理HK-2细胞后3h已经开始表达明显下调(P<0.05),并随着处理时间的延长逐渐降低。炎症因子TNF-a、IL-1β在LPS处理细胞后1h,相对表达明显上调,3h后开始明显下调,即炎症爆发后表达量逐渐恢复;LPS处理后细胞中IL-6表达量开始上升,6h达到高峰,而后数小时内降低到初始水平。Sepsis-AKI细胞模型中miR-30e-3p、miR-30e-5p、miR-30a-5p的表达水平与炎症因子IL-1β表达成正相关(相关性系数r分别为0.5187、0.6326、0.5893),具有统计学意义(P<0.05),而miR-30a-3p的表达与IL-1β表达无统计学意义上的相关性(P>0.05);各组miRNA(包括miR-30e-3p、miR-30a-3p、miR-30e-5p、miR-30a-5p)与炎症因子TNF-a、IL-6在表达水平上都没有统计学意义上的相关性(P>0.05)。4、miR-30a-3p靶基因的预测与验证。通过多个数据库检索及生物信息学预测并筛选发现,TEAD1可能是受miRNA-30a-3p调控的靶基因。用脂质体lipo-3000将miRNA-30a-3p mimics以及miRNA-30a-3p inhibitor导入到HK-2细胞中,转染后的miRNA-30a-3p在mimics组中明显高表达;Inhibitor组表达量无明显变化。靶基因TEAD1的唯一转录本mRNA在转染了miRNA-30a-3p inhibitor组中明显上调(P=0.0008),而在转染了miRNA-30a-3p mimics组的表达改变无统计学意义。转染后Inhibitor组的TEAD1表达明显升高(P<0.0001);而mimics组表达明显降低(P<0.01)。研究结论1、miR-30家族中的miR-30e-3p和miR-30a-3p、miR-30e-5p、miR-30a-5p在Sepsis-AKI的病理过程中表达明显下调,并在24h内随着疾病进展时间的延长逐渐降低。具有作为诊断Sepsis-AKI的生物标志物的潜能。(创新)2、在Sepsis-AKI过程中,炎症因子TNF-α,IL-1β在炎症反应过程中快速爆发性上升而后迅速下降,IL-6具有相同的上升下降趋势,但时间上表现在TNF-α,IL-1β之后。(验证)3、在Sepsis-AKI体外实验中miR-30e-3p、miR-30e-5p、miR-30a-5p的表达水平与促炎症因子IL-1β表达成正相关,尤其是miR-30e-3p,在体内和体外实验中都呈现出与IL-1β表达的正相关性。(创新)4、TEAD1可能是miR-30a-3p的直接靶基因。(创新)5、假设:在Sepsis-AKI的发展过程中,LPS通过下调miR-30a-3p的表达,以上调靶基因TEAD1进而影响其所在的Hippo信号通路对细胞增殖和凋亡产生一些列的调控与影响。