研究背景恶性胶质瘤(WHO分级Ⅲ级、IV级)是临床常见的神经外科疾病,在中青年死亡原因中排名前列,因其治疗的复杂性,低生存率以及近年来逐渐增高的发病率,已成为神经外科领域现阶段研究的热点。恶性胶质瘤存在广泛浸润、颅内转移的特点,即使在手术中显微镜下全切肿瘤,术后短时期内仍有极高的复发率。因此术后放、化疗等综合辅助治疗在胶质瘤的治疗中具有很大的意义,对于改善患者生存质量,提高生存时间有很高的价值。而由于中枢神经系统存在血脑屏障等原因,恶性胶质瘤的化疗方案相对于全身其他系统恶性肿瘤的化疗不尽相同,大部分以烷化剂为化疗的基础。06-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶(06-methylguanine-DNA-methyltransferase MGMT)是哺乳动物机体中都存在的一种DNA烷基化损伤修复酶,它同时发挥转移酶与甲基接受体的作用,将烷化基团从O6-MG(06-甲基鸟嘌呤)的六位氧转到自身的半肤氨酸残基上,使DNA链上的鸟嘌呤损伤修复,阻止DNA交联形成。因此MGMT可抵消烷化剂对肿瘤细胞造成的DNA烷基化毒性作用,因此在肿瘤化疗的众多耐药因素中,起到重要作用。在胶质瘤烷化剂化疗中,MGMT活性被视为提示患者预后的一个极其重要的分子指标,在研究者间具有广泛的共识,MGMT活性高,则烷化剂化疗耐药性强,患者生存期预后差。反之则预示好的预后。MGMT活性可通过MGMT的DNA、RNA、蛋白等各个层面的各种检测方法进行研究。因RNA提纯难度高,降解快等特点,在RNA层面进行的MGMT研究较少,难以形成综合分析。免疫组化法检测的MGMT蛋白表达在过去被一致认为是烷化剂耐药、患者生存期预后的高度可信分子预测指标,但是在近年来受到大量分析研究结果的挑战,认为IHC法检测的MGMT蛋白表达与同组标本组织启动子甲基化状态以及患者预后一致性差,尤其是其中一些META分析和多中心大样本研究对MGMT蛋白表达作为预后指标的质疑有一定的说服力。近些年来的研究证实肿瘤的发生与表观遗传学的改变有关。表观遗传学研究非基因序列改变所致的可遗传的基因表达水平的变化,基因启动子区CpG岛局部甲基化水平异常升高是属于表观遗传学改变的一种,可导致相关基因不表达,蛋白水平下降。使得肿瘤细胞耐药性降低,患者获得更好的预后。MGMT基因启动子甲基化状态作为烷化剂耐药、患者生存期预后指标,在近几年得到了广泛的认可。以往甲基化特异性的PCR (MSP)法作为大多数研究中检测启动子甲基化状态的首选方法,目前由于不能做定量分析等缺陷,该方法受到各种质疑,新研究的启动子甲基化检测方法中,可行甲基化状态的定量、半定量分析,各有优缺点。其中甲基化特异性-多重连接依赖性探针扩增技术(Methylation-specific multiplex ligation-dependent probe amplification, MS-MLPA)由MLPA技术发展而来,是一种将探针杂交与PCR扩增相结合的基因甲基化检测技术。相比经典的MSP法,MS-MLPA法有明显的优势：所需检测样本量小；可省略亚硫酸氢盐转化步骤；同一引物对扩增所有探针增加了可靠性；可得到半定量的甲基化结果。可用于FFPE等局部降解的DNA；分辨率高,可以同时获得基因拷贝数信息等。是一种值得信赖的检验方法。本研究选用的MS-MLPA ME011-B1MMR试剂盒检测MGMT甲基化状态,大致实验步骤为：首先变性反应使靶序列成为为单链。随后杂交反应中,长、短探针中的杂交序列与单链靶序列杂交互补。MS-MLPA在杂交反应后分两部分进行。一半同常规MLPA的后续连接、扩增、电泳反应,提供拷贝数信息。另一半反应要在MLPA的连接反应步骤中同时加入甲基化敏感性限制性内切酶Hhal处理,以提供甲基化状态信息。在连接反应中同时加入Hhal内切酶,若靶序列的GCGC位点非甲基化,探针被连接的同时将被Hhal消化,不能在后续的PCR反应中被扩增；若GCGC位点是甲基化的,探针不会被Hhal消化,连接后的完整探针通过通用引物由PCR反应扩增,最终通过电泳分离,产生电泳峰值信号。信号数据经一系列校正和评估后,用计算机软件来计算,得出该序列的甲基化系数。目的研究MGMT基因启动子过甲基化状态、MGMT基因拷贝数、MGMT蛋白表达与患者生存预后关系以及与患者年龄、性别、病理分级等临床特点的关系,探讨MS-MLPA法检测基因甲基化状态的优势和不足,研究IHC法检测蛋白表达存在的各种问题,为MGMT活性高的胶质瘤术后综合治疗作出参考。研究方法实验标本：所有脑胶质瘤石蜡标本来自南方医科大学珠江医院病理科,所有非肿瘤性对照标本取自南方医科大学珠江医院神经外科手术。观察对象：选择自2006至2010年间在南方医科大学珠江医院神经外科治疗、术后病理证实为脑恶性胶质细胞瘤(按WHOⅢ级、IV级)患者39例,其中男性24例,女性15例,年龄20-68岁,平均46.9岁,病理分级WHOⅢ级19人,WHO Ⅳ级20人。所有患者均于术后放疗加TMZ(替莫唑胺)化疗。同时选用6例非肿瘤性脑组织标本做为对照组。观察方法：追踪病人的总生存时间(OS)。以免疫组化法检测胶质瘤组织MGMT蛋白表达,以MS-MLPA法检测MGMT基因启动子甲基化以及基因拷贝数状态。将患者按MGMT蛋白表达情况、MGMT基因启动子甲基化以及基因拷贝数状态分组,评价三者与患者生存期的关系。并观察MGMT蛋白表达以及MGMT启动子甲基化状态与患者年龄、性别、病理分级之间的关系。统计学方法：数据采用SPSS13.0统计软件分析。探讨MGMT蛋白表达、甲基化状态、拷贝数与生存期的关系用Kaplan-Meier法,生存时间表示为均数±标准误。整体比较采用Log-Rank检验并绘制生存曲线图,若整体比较存在统计学差异则进一步进行组间多重比较。分析MGMT蛋白表达情况与MGMT启动子甲基化状态之间相关性采用Spearman相关系数；MGMT蛋白表达情况以及MGMT启动子甲基化状态分别与患者年龄、性别、病理分级之间的关系用χ2检验进行统计分析。当P<0.05时差异有统计学意义。实验步骤：对胶质瘤石蜡标本行免疫组化染色,DAB法显色。阳性对照为已知的MGMT阳性的胶质瘤组织。PBS液代替一抗作为阴性对照。结果判断：MGMT阳性染色定位于细胞核或细胞浆,呈棕黄色。按MGMT表达情况分成三级：无任何MGMT阳性表达者及MGMT阳性细胞数<10%为阴性(-)；阳性细胞数10%-30%为弱阳性(+)；>30%阳性细胞数为强阳性(++)。以MS-MLPA法检测石蜡标本MGMT基因启动子甲基化,选择6份非肿瘤性人脑石蜡包埋组织作为参考样本,并设置一个以蒸馏水代替样本DNA的无DNA阴性对照反应。首先用凯杰QIAAMP DNA FFPE TISSUE试剂盒提取石蜡包埋组织的基因组DNA并检测浓度(50ng/ul)。按照DNA变性、杂交、连接、PCR扩增和电泳分离检测的顺序行MS-MLPA检测,电泳数据经相应的软件分析,计算出的拷贝数系数和甲基化率。结果判断：拷贝数系数0.8-1.2者为正常,MGMT拷贝数系数<0.8者视为拷贝数缺失；拷贝数系数>1.2者视为拷贝数增多。MGMT探针甲基化比率<0.25,即样本未甲基化；0.25<甲基化率<0.5,即样本低度过甲基化；0.5<甲基化率<0.75,即样本中度过甲基化。甲基化率>0.75,即样本高度过甲基化。结果1、蛋白表达与患者OS(总生存期)关系：(1)若将标本分为MGMT-、 MGMT+、MGMT++三组蛋白表达,观察与患者总生存期的关系,MGMT-组与MGMT++组生存时间存在统计学差异(P=0.001),其他组间生存时间无统计学差异。(2)若将标本分为MGMT-、MGMT+/++两组蛋白表达观察,组间生存时间存在统计学差异(P=0.003)。2基因启动子甲基化状态与患者OS关系：未甲基化、低度过甲基化、中度过甲基化、高度过甲基化四组生存时间均存在显著统计学差异(P<0.001)。拷贝数状态与患者OS关系：拷贝数缺失、拷贝数正常、拷贝数增多3组间生存时间整体比较无统计学差异(P=0.938)。3、男女两组组患者之间、≥50岁和<50岁两组患者之间、WHOⅢ级和Ⅳ两组患者之间的MGMT蛋白表达差异都没有统计学意义。男女两组组患者之间、≥50岁和<50岁两组患者之间、WHOⅢ级和Ⅳ两组患者之间的甲基化状态差异也都没有统计学意义。4、恶性胶质瘤组织MGMT蛋白表达与MGMT基因启动子甲基化状态存在统计学相关性,Spearman秩相关系数为0.697(P<0.001)。结论1、MS-MLPA法检测MGMT基因启动子甲基化状态是一种可靠的方法。相比经典的MSP法,MS-MLPA法具有优势。2、恶性胶质瘤组织MGMT基因启动子甲基化状态与患者生存期存在显著相关性,甲基化率越高者预后越好。与患者年龄、性别、病理分级无相关性。恶性胶质瘤组织基因拷贝数状态与患者生存预后无相关性。3、恶性胶质瘤组织MGMT表达与患者生存预后存在相关性,表达阳性者比表达阴性者生存率更低。IHC法仍需在MGMT-、MGMT+、MGMT++界定值等方面作出改进。MGMT蛋白表达与患者年龄、性别、病理分级无相关性。4、MGMT蛋白表达与MGMT基因启动子甲基化状态存在相关性。两者均可以作为接受烷化剂化疗的恶性胶质瘤患者的生存预后指标。但MGMT基因甲基化应作为MGMT活性检测的首选方法。5、MGMT活性高的胶质瘤患者治疗效果仍不理想,应继续在降低肿瘤耐药性等多方面开展研究,以期提高整体疗效。