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草莓属植物均开白花,红花草莓是开白花的栽培草莓（Fragaria×ananassa,2n=8x=56）与开红花的沼委陵菜（Potentilla palustris,2n=6x=42）属间杂交得到的远缘杂种,其花为红色或粉色,是研究花瓣呈色机理的理想试材。红花草莓花色鲜艳,可用于多年生宿根观赏的草本花卉,因其具有较高的观赏兼食用价值而颇受欢迎。花瓣颜色作为红花草莓最主要的观赏性状,由于花青苷积累程度不同,而表现出不同程度的红色系花瓣。mi RNAs作为重要的转录后调控因子,在植物中发挥着重要的作用,有哪些mi RNAs起作用参与红花草莓花瓣颜色变化的转录后调控尚不清楚。因而,为了阐明红花草莓花色形成的转录后调控机制,选取红花草莓品种‘四季红’幼蕾期、转色期、大蕾期三个发育阶段的花蕾,构建9个不同发育阶段花瓣的小RNA文库、转录组文库和混合降解文库,进行了mi RNAs测序、转录组测序和降解组测序,并进行了联合分析。利用多种生物信息学手段,筛选到与花瓣颜色调控相关的差异表达的mi RNAs-targets,分别为Fami R858＿R-2-Fa Myb308、Fami R159d-Fa GAMYB、Fami R828a-Fa MYB114、Fami R396e-Fab HLH79和Fami R156a-Fa SPL13A,对其分别进行了克隆、过表达载体构建、生物信息学分析、系统进化树构建以及功能分析等,确定这些候选mi RNAs在花蕾发育过程中的功能,研究结果将为深入解析红花草莓花瓣呈色的分子机制提供理论基础,试验主要结果如下:1.通过小RNA测序,共鉴定出739个已知的mi RNAs和964个新的mi RNAs,通过转录组测序,筛选到了8149个差异表达的基因;根据降解组数据,共鉴定出639个mi RNAs靶向2816个靶基因。此外,发现317个差异表达的mi RNAs,它们靶向调控了2134个差异表达的基因,这些靶基因在转录调控、苯丙烷生物合成和植物激素信号转导等途径中显著富集。通过多组学联合分析发现,有98个差异mi RNAs靶向多个与花色合成调控相关的差异转录因子,包括MYBs（26）、b HLHs（12）、NACs（14）和SPLs（19）等,没有发现mi RNAs直接调控与花青苷生物合成相关的结构基因。此外,27个差异表达的mi RNAs可能通过调控与激素信号转导通路中的23个靶基因来影响花青苷的生物合成。2.根据降解组数据及差异表达的mi RNA-target的表达情况,共有8个Fv MYBs被不同的mi RNAs靶向且呈相反的表达趋势。通过与拟南芥中的At R2R3-MYBs构建系统发育树,发现Fv Myb308和Fv GAMYB属于抑制花青苷合成的亚群4,Fv MYB114属于促进花青苷生物合成的亚群6,亚群7中的Fv MYB4和Fv MYB5调控了红色花草莓花瓣中黄酮类化合物的合成,因此,相应的mi RNAs可能在红花草莓花瓣着色中具有重要的调控作用,包括Fami R828a（靶向Fv MYB114 Fv H4＿2g310201.1）、Fami R159d-R-1（靶向Fv GAMYB Fv H4＿7g04470.1）和Fami R858＿R-2（靶向Fv Myb308 Fv H4＿2g01320.1）。这表明Fami R828a可能通过靶向Fa MYB114抑制红花草莓花瓣花青苷的积累,Fami R858＿R-2通过靶向Fa Myb308促进红花草莓花瓣中花青苷的积累。3.通过与Atb HLHs的系统发育分析,发现5个Fvb HLHs（Fvb HLH30、Fvb HLH77、Fvb HLH79、Fvb HLH113和Fvb HLH137）可能与花青苷合成有关,它们对应的mi RNAs可能影响红花草莓的花瓣着色,包括zma-mi R396f-p5（靶向Fvb HLH30）、mdm-mi R393a（靶向Fvb HLH77）、mdm-mi R396e（靶向Fvb HLH79）、nta-mi R172e-p3（靶向Fvb HLH113）和osa-mi R5826＿L-4R-2（靶向Fvb HLH137）。小RNA测序结果表明,这5个mi RNAs中,只有mdm-mi R396e的表达水平是高的,其余均为低表达水平;转录组测序结果表明,Fvb HLH79在花蕾的发育过程中,其表达量增加,而Fami R396e的表达量减少。这些研究结果表明,Fami R396e和Fab HLH79在调控花青苷积累中具有重要作用。4.mi R156s通过靶向SPL转录因子正向调控花青苷的生物合成,而SPLs通过MYB-b HLH-WD40复合物负向调控花青苷的积累,本研究中,筛选到18个mi R156s靶向了5个Fv SPLs,在花的发育过程中Fami R156s的表达水平逐渐增加,与它们的靶基因表达水平相反;鉴定了5个参与植物激素信号转导的mi RNAs并通过q RT-PCR分析进一步验证了与其靶基因的调控关系,结果表明Fami R160s随着花瓣发育,表达量逐渐下降,然而其靶基因Fa ARFs的表达量显著增加;Fami R172a＿R+1在大蕾期高度积累,与靶基因Fa ERF（Fv H4＿6g15180.1）相反,Fami R156f-p5及其靶基因Fa CTR1（Fv H4＿3g39380.1）也表现出相同的趋势。5.克隆筛选到的与红花草莓花瓣呈色相关的mi RNAs-targets,结果表明:Fami R858＿R-2的前体序列为68 bp,其靶基因Fa Myb308的编码区序列为828 bp,编码275个氨基酸;Fami R159d的前体序列为96 bp,其靶基因Fa GAMYB的编码区序列为1689 bp,编码562个氨基酸;Fami R828a的前体序列为126 bp;Fami R396e的前体序列为164 bp,其靶基因Fab HLH79的编码区序列为804 bp,编码267个氨基酸;Fami R156a的前体序列为104 bp,其靶基因Fa SPL13A的编码区序列为1024 bp,编码411个氨基酸。此外,所有的mi RNAs-targets构建的系统进化树均与蔷薇科植物聚类在一起,表明与蔷薇科植物亲缘关系较近、功能相似且克隆结果准确。6.对最终筛选到的mi RNAs-targets关系对（Fami R858＿R-2-Fa Myb308、Fami R828a-Fa MYB114、Fami R396e-Fab HLH79和Fami R156a-Fa SPL13A）构建p RI-101AN融合过表达载体,并将过表达mi RNAs瞬时侵染红花草莓品种‘粉韵’,以注入p RI-101AN的花瓣作为对照,观察注射后3-7天内花色表型的变化。通过q RT-PCR及花青苷含量测定,结果表明在‘粉韵’中瞬时侵染Fami R156a、Fami R396e和Fami R858＿R-2增加了花色强度,促进了花青苷的积累,而Fami R828a的瞬时表达降低了花色强度,抑制了‘粉韵’中花青苷的积累。