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研究背景：随着社会人口老龄化趋势增长，糖尿病溃疡、放射性溃疡、压力性溃疡等慢性创面发病率明显增加。因此，创面愈合已经成为现代医学研究重点之一。创面愈合是局部组织的再生，涉及到表皮结构再生和真皮组织重构的复杂生物学过程。目前，创面愈合确切机制尚未明确，组织修复的效果尚不能令人满意。有关创面愈合分子机制已成为学者们关注的热点。进一步深入研究创面愈合分子机制，有利于拓展创面治疗的思路和手段，对提高创面愈合的速度和质量具有积极意义。整合素连接激酶（integrin-linked kinase，ILK）是一种组织器官广泛表达的丝氨酸/苏氨酸激酶。它介导PKB/AKT、Wnt、LEF-1和β-catenin等多种细胞信号通路调控，对细胞的迁移、增殖、分化和凋亡等生物学功能起重要作用，并介导细胞-细胞及细胞与细胞外基质（extracellular matrix，ECM）之间的相互作用。国内外最新研究发现ILK在维持皮肤真皮稳态方面发挥重要作用，是损伤修复必不可少的细胞应答组成部分[1-2]。本课题前期研究在细胞水平发现ILK能够通过AKT下游信号通路参与成纤维细胞（fibroblast，Fb）的迁移、分化、增殖、凋亡，影响创面愈合，同时也发现ILK与大鼠烧伤创面愈合有高度相关性，但ILK对烧伤创面愈合的作用机制还需进一步探讨。本研究以大鼠皮肤深Ⅱ°烧伤创面为模型，利用ILK重组慢病毒技术转染大鼠创面周围，上调ILK表达；同时使用ILK特异性抑制剂QLT0267抑制ILK活性，观察ILK在创面愈合过程中的作用以及与Fn、I型胶原、α-SMA和AKT磷酸化的关系，这将有助于完善创面愈合的分子生物学理论，为创面分子水平和基因治疗提供新思路。第一部分烧伤创面动物模型的制备目的制备稳定准确的大鼠烧伤创面模型。方法20只SD大鼠随机分为4组，采用恒温恒压烫伤仪分别致伤4、6、8、10s，致伤过程以底面积2.5cm2、质量0.5kg的80℃圆柱形烫头垂直接触大鼠脊柱左右两侧对称皮肤，24h后采集各组大鼠的创面组织行病理组织学检查，根据病理结果筛选出深Ⅱ°创面的致伤时间，制备大鼠皮肤烧伤创面模型。结果根据病理切片检查证实8s烫伤的实验创面为深Ⅱ°烧伤创面。结论应用YLS-5Q型烫伤仪底面积2.5cm2、质量0.5kg、烫头温度80℃、作用时间8s致伤大鼠背部皮肤，可制备深Ⅱ°烧伤模型。第二部分烧伤创面内ILK基因转染及对创面愈合率的影响目的探讨烧伤创面内ILK基因转染及对创面愈合率的影响。方法采用ILK重组慢病毒载体，将三质粒系统共转染293T细胞包装慢病毒，用Western Blot法检测目的基因ILK质粒表达。正式试验采用SD大鼠75只，在其背部皮肤制备深Ⅱ°创面，并随机分成5组，每组15只，分别是：①对照组：每天注射生理盐水100μL；②LV-GFP组：一次性注射空质粒慢病毒100μL （2E+8TU/mL）；③LV-GFP-ILK组：一次性注射ILK过表达慢病毒液100μL（2E+8TU/mL）；④QLT0267组：每天注射浓度100μMQLT0267液100μL；⑤DMSO组：每天注射含0.3%DMSO液100μL。实验持续21d，各组大鼠单独饲养，自由采食和饮水。测量各组大鼠创面愈合时间和愈合率。LV-GFP-ILK组用慢病毒液注射大鼠创面周围皮下，于注射后第14d取材，每组5只大鼠，标本行冰冻切片，倒置荧光显微镜下观察GFP表达情况；于注射后第7d、10d、14d、21d取材，Western Blot法检测转染后ILK蛋白表达，所得数据进行统计分析处理。结果LV-GFP-ILK组大鼠创面皮肤样品的冰冻切片在荧光显微镜可见GFP表达，且ILK蛋白表达水平高LV-GFP组。第14d时，LV-GFP-ILK组创面愈合率为96.89%，QLT0267组创面愈合率56.32%，在各个时相均显著低于其他3组（P<0.05），对照组、LV-GFP组和DMSO组三组之间创面愈合率无统计学意义（P>0.05）。结论皮下注射ILK重组慢病毒能成功感染大鼠创面周围的正常组织，并能显著上调ILK蛋白水平，且这一效应相对持久、稳定。上调ILK表达创面愈合率增高，抑制ILK活性则创面愈合率降低，说明ILK具有促进创面愈合作用。第三部分ILK在创面愈合过程中的作用以及与Fn、I型胶原、α-SMA和AKT磷酸化的关系目的通过上调ILK表达或抑制ILK活性，检测Fn、I型胶原、α-SMA等影响创面愈合过程的重要蛋白表达，探讨ILK在创面愈合过程的作用及其可能机制。方法动物试验分组及处理同第二部分。在试验第14d，各组随机选择5只大鼠，应用免疫组化SP法和Western Blot法分别检测ILK、AKT、PAKT在各组大鼠创面中的表达；对创面肉芽组织进行组织学染色，观察创面及周围组织结构的改变；PCR检测大鼠皮肤组织Fn、I型胶原、 ILK、α-SMA的基因表达。结果SP法和Western Blot法检测：5组AKT蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05），LV-GFP-ILK组ILK蛋白表达增高（P<0.05）， PAKT蛋白表达也明显增高（P<0.05），创面新生表皮更厚、胶原沉积率更多； QLT0267组PAKT蛋白表达较其他组明显降低（P<0.05）。PCR检测显示ILK mRNA表达增强后Fn mRNA、I型胶原mRNA、α-SMAmRNA表达增强。结论烧伤创面组织中ILK水平提高能显著上调Fn、I型胶原、α-SMA基因的表达；ILK活性与PAKT蛋白表达量呈正相关。因此，ILK可能通过PI3K-AKT-PAKT途径，促进创面的愈合。