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本研究通过建立神经母细胞瘤细胞(SHSY5Y)体外模拟缺血再灌(imitative ischemia-reperfusion)模型,探讨神经细胞凋亡的途径及褪黑素(melatonin,MT)和N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)抗氧化、抗凋亡的作用机制,为缺血再灌注诱导脑神经元凋亡的基础性研究和临床有效防治老年(血管)性痴呆(Vascular dementia,VD)提供新的理论依据。体外常规培养人神经母细胞瘤细胞株SHSY5Y,然后模拟缺血再灌注培养(先缺糖缺氧,后正常培养)建立细胞模型;实验分正常对照组、缺氧再灌组及MT/NAC药物组;琼脂糖凝胶电泳、流式细胞仪和透射电镜检测细胞凋亡情况;MTT法检测细胞生存活力;荧光比色法检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)产生;HLPC检测兴奋性神经递质谷氨酸(Glutamate,Glu)的释放;分光光度法检测Caspase-3活性和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性;western blotting及ELISA法检测细胞色素C(cytochrome C,Cyt.C)释放;激光共聚焦显微镜及荧光比色法观察线粒体跨膜压(△ψm)改变。实验观察模拟缺血再灌注诱导的神经细胞凋亡过程是否主要通过线粒体凋亡途径,褪黑素和N-乙酰半胱氨酸是否通过抗氧化、抗线粒体凋亡而具有神经元保护作用。SHSY5Y细胞在模拟缺血90min再灌24h后,琼脂糖凝胶电泳出现典型凋亡特征的DNA片段化,流式细胞仪检测也证实有大量凋亡细胞存在,透射电镜获得清晰可见的凋亡细胞亚微结构图像;模拟缺血再灌注处理后细胞内兴奋性神经递质Glu大量释放,比正常对照组高出70.2%(P<0.01);细胞内LDH大量释放,培养液中LDH活性与对照组相比增加41.7%(P<0.01);细胞内活性氧(ROS)在模拟缺血90min再灌注Omin时即明显升高,30min时达到最高点,与对照组相比,P<0.01;模拟缺血90min再灌1h后线粒体跨膜电位明显下降(与对照组相比,P<0.01),3h后迅速升高,6h后又下降,直到24h也没有恢复;细胞色素C在模拟缺血90min再灌3h后开始释放,6h达到最高峰(与对照组相比,P<0.01),直到24h后依然维持较高水平;Caspase-3活性在缺血90min再灌0-24h内,随着再灌注时间延长逐渐增加,再灌12h后显著增加,与对照组相比,P<0.01。褪黑素和N-乙酰半胱氨酸均能显著降低再灌组细胞内ROS的产生,降低再灌组细胞内兴奋性神经递质谷氨酸的释放,抑制再灌组线粒体细胞色素C大量释放,抑制再灌组Caspase-3的活性及抑制线粒体跨膜压的降低,保护线粒体结构和功能,提高细胞生存活力。模拟缺血再灌注诱导的SHSY5Y细胞凋亡及凋亡信号转导主要通过线粒体介导途径;褪黑素和N-乙酰半胱氨酸可能通过其抗氧化和抗线粒体凋亡作用对缺血再灌注诱导的人神经细胞凋亡起保护作用。