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目的:设计有效抑制表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因表达的小干扰RNA(short interfering RNA,siRNA)序列,构建相应的真核表达载体,转染到人晶状体上皮细胞(Human lens epithelial cells,HLEs)中,研究其对HLEs细胞生物学特性的影响;同时筛选出促进HLEs细胞增长的重组表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)的最适宜浓度,进一步研究在最适宜浓度的EGF刺激下,EGFR的siRNA对HLEs细胞生长的影响,从而明确EGFR的siRNA的抑制效果,并推断出si-EGFR抑制HLEs细胞增长的分子机制。方法:1、根据siRNA设计原则,设计并体外化学合成靶向EGFR基因的特异性短发卡状 RNA(short hairpin RNA,shRNA),克隆到 pSilencer2.1-U6neo 载体中,构建si-EGFR的表达载体,同时以pSilencer2.1-U6neo空转载体为阴性对照,在脂质体介导下分别转染HLEs细胞,以免疫荧光技术定位EGFR;实时荧光定量PCR(Real time FQ-PCR)检测HLEs中EGFR的mRNA水平上表达的变化;Western-blot蛋白印迹法检测EGFR在蛋白表达上的变化;MTS法及细胞生长曲线分别检测细胞增殖活性;流式细胞术检测细胞生长周期变化。2、体外传代HLEs细胞,以不同浓度(0.1、1、10ng/mL)的外源性重组EGF分别刺激HLEs,观察HLEs细胞的形态变化和生长情况,自加入重组EGF即刻起,通过MTS法连续4d测量各组细胞光密度(Optical Density,OD)490及570的值;同时连续7d计数细胞个数,绘制细胞生长曲线以检测细胞增殖活性,从而寻找能促进HLEs细胞生长的重组EGF的最适宜浓度。3、分别转染pSilencer2.1-shRNA-EGFR及pSilencer2.1-U6neo空转载体两组质粒到HLEs细胞,并在两组转染后的细胞中加入最适宜浓度的等量重组EGF,通过MTS法连续4d检测细胞OD490和OD570数值,并连续7d计数细胞个数,绘制细胞生长曲线,观察在EGF干扰下,EGFR的siRNA对HLEs细胞增殖的影响。结果:1、Western-blot蛋白印迹法与Real time PCR检测法的结果一致,转染细胞48h后,si-EGFR实验组中EGFR的mRNA表达水平是阴性对照组的0.450625倍;蛋白水平si-EGFR实验组是阴性对照组的0.1194倍,是空白对照组的0.1149倍,组间比较差异具有统计学意义(P＜0.01)。这些结果表明构建的si-EGFR表达载体pSilencer2.1-shRNA-EGFR无论在分子水平还是蛋白水平均明显抑制EGFR的表达。2、流式细胞检测技术结果表明,72h之后,转染了 si-EGFR质粒的HLEs,G1期细胞占到41.6%,而未进行基因沉默的阴性对照组G1期的细胞占到29.5%;同时转染了 si-EGFR质粒的HLEs细胞,G2期占到27.5%,而阴性对照组G2期的细胞占到43.7%;转染了 si-EGFR质粒的HLEs细胞,其增殖指数为140.4%,而阴性对照组的增殖指数为239%。以上结果显示:si-EGFR影响了 HLEs细胞从G1期进入S期,从而作用于细胞周期进程。MTS法及细胞生长曲线的结果一致,证实了转染了 si-EGFR质粒的HLEs细胞自转染后24小时开始,生长活性明显降低,且随着时间推移,生长活性降低的更为明显(P＜0.01)。3、以不同浓度的重组EGF刺激HLEs细胞发现:在一定范围内,重组EGF浓度增高,细胞的增殖活性也随之增高,当重组EGF浓度为1ng/mL时,HLEs细胞的增殖活性最强,但是超过了这个范围,高浓度的EGF反而会抑制细胞生长;细胞生长曲线检测结果与MTS结果一致。4、转染了 si-EGFR质粒的HLEs细胞尽管受到了最适宜浓度重组EGF的刺激,但是细胞增殖不明显,而阴性对照组在接受了 1ng/mL重组EGF的刺激后,细胞增殖活性显著提高,MTS检测结果与细胞生长曲线一致,两组组间比较差异具有统计学意义(P<0.01)。结论:1、体外化学合成的pSilencer2.1-shRNA-EGFR表达载体在分子水平及蛋白水平上均能明显降低HLEs细胞中EGFR的表达,并因而有效抑制了 HLEs细胞的增殖活性。靶向si-EGFR为预防后发性白内障提供了新的思路。2、适宜浓度的重组EGF可以刺激HLEs细胞的生长,过高浓度的重组EGF反而会抑制细胞的生长,1ng/ml的重组EGF最有利于促进HLEs细胞的生长。3.、适宜浓度的重组EGF也不能促进si-EGFR作用过的HLEs细胞的增殖,因此我们推断转染了 pSilencer2.1-shRNA-EGFR的HLEs细胞,其增殖活性的降低是通过EGF-EGFR通路的阻断得以实现的。