研究背景：脑卒中是一种常见的急性脑血管疾病，是目前全世界三大死亡原因之一，包括缺血性和出血性卒中两大类，在全世界具有较高的发病率和致残率。随着我国人口老龄化进程不断加快，脑缺血给患者家庭及社会健康资源带来了日益严重的负担，针对脑缺血发病的相关靶点研发预防及治疗药物已成为迫切需要。当脑组织出现供血供氧不足时，会通过细胞毒性损伤、氧化应激、炎症反应等多种机制导致缺血部位细胞的凋亡。其中，炎症反应在脑缺血进程中发挥着十分重要的作用。缺血部位细胞分泌的炎性细胞因子IL-1β、TNF-α、E-选择素、P-选择素、细胞间粘附分子（ICAM-1）以及趋化因子等促进了炎性细胞向缺血部位的浸润，并导致缺血部位血脑屏障通透性的改变，进一步加重缺血部位血管阻塞，最终出现“无复流”（No-reflow）现象。因此，抑制缺血部位的炎症反应对于缺血部位损伤保护意义重大。本课题组前期研究发现一种具有抗炎活性的五肽MLIF可以降低脑缺血模型大鼠、小鼠脑梗死面积，并发现MLIF在脑微血管内皮细胞中作用于真核翻译延长因子1A1（eukaryotic elongation factor1A1，eEF1A1），可以升高eNOS表达从而降低脑缺血导致的ICAM-1、VCAM-1水平的升高，减少缺血部位细胞的损伤。本课题拟在前期研究基础上对eEF1A1在脑缺血中的保护作用进行进一步研究，为脑缺血的预防及治疗提供新的思路。方法与结果：1、采用免疫共沉淀方法找到在bEnd3细胞内与eEF1A1存在相互作用的蛋白，经质谱鉴定并与蛋白质数据库比对，发现相互作用的蛋白为HSC70。2、通过Western Blot方法与免疫荧光法对免疫共沉淀结果进行验证。免疫共沉淀得到的蛋白通过Western Blot方法杂交HSC70抗体，ECL显色并用胶片显影后发现71kD处有清晰条带；用免疫荧光方法也观察到eEF1A1与HSC70在胞浆中存在共定位，确证了bEnd3细胞内与eEF1A1相互作用的蛋白为HSC70。3、采用RNA干扰技术分别抑制eEF1A1与HSC70蛋白表达，Western Blot方法检测另一蛋白的表达，结果显示分别抑制eEF1A1与HSC70蛋白的表达后，另一蛋白的表达并未受到影响。而采用免疫共沉淀技术观察缺氧前后这两个蛋白的结合情况，发现eEF1A1与HSC70结合随着缺氧刺激时间的增加呈现先降低后升高的趋势，表明缺氧可能影响eEF1A1与HSC70的结合。说明eEF1A1与HSC70可能以分子伴侣形式在缺血性脑卒中进程中发挥保护作用。其确切机制尚待进一步研究。4、分别将eEF1A1与HSC70基因敲减后，采用Annexin V-FITC/PI双染法染色细胞,流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。结果显示，HSC70siRNA转染48h后细胞凋亡率高达50%，明显高于阴性对照组（P＜0.01）；虽然eEF1A1基因敲减的正常细胞未出现明显凋亡，但是缺氧处理8h后RNAi组凋亡率明显高于对照组。表明eEF1A1与HSC70具有抑制缺氧诱导的细胞凋亡作用。5、Western Blot方法检测缺氧诱导bEnd3细胞中凋亡相关蛋白变化，我们发现缺氧刺激细胞后，JNK相关信号传导通路中磷酸化JNK、磷酸化c-JUN（Ser63、Ser73）、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3蛋白水平均会升高，这一现象可以被JNK抑制剂sp600125抑制，从而证明缺氧刺激可以激活JNK相关信号通路，导致细胞凋亡。6、向细胞内分别转染eEF1A1siRNA和HSC70siRNA48h后用Western Blot方法检测JNK信号通路中相关蛋白变化。结果表明，HSC70基因敲减组中磷酸化JNK、磷酸化c-JUN（Ser63、Ser73）、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3表达均明显高于阴性对照组（P＜0.01）；eEF1A1基因敲减细胞在给予缺氧刺激后上述蛋白水平高于阴性对照组（P＜0.01）。表明eEF1A1与HSC70可以通过抑制JNK信号通路的激活发挥脑缺血保护作用。7、基于文献报道，在对bEnd3细胞给予不同时间缺氧刺激后，观察分子伴侣介导的自噬相关蛋白HSC70以及LAMP-2A蛋白水平变化，发现不同缺氧刺激时间下HSC70与LAMP-2A蛋白表达无明显差异，eEF1A1RNAi组与对照组相比两者表达也无明显差异，表明eEF1A1与HSC70未通过分子伴侣介导的自噬发挥脑缺血保护作用。结论：1、在bEnd3细胞中，eEF1A1与HSC70之间存在分子伴侣形式的相互作用。2、eEF1A1与HSC70可以通过抑制JNK信号传导通路的激活在缺血性脑卒中进程中发挥保护作用。