随着纳米技术的迅速发展,纳米材料逐渐被应用到生命科学与医学领域中,从而为生命科学与医学的研究和发展提供了新的技术和手段。磁性纳米颗粒(magnetic nanoparticles,MNPs)作为纳米材料的一个重要组成部分,目前已被广泛应用于各种生物分子的检测等方面。化学发光具有安全、高灵敏度、线性范围宽等特点,为疾病的分子检测提供了一个良好的平台。本论文以肝炎为检测对象,结合化学发光和磁分离技术的优点,建立了几种快速、高通量、灵敏和实用的肝炎分子检测新技术。具体内容包括:1.功能化磁性纳米颗粒的制备及在核酸提取中应用为提高磁性纳米颗粒功能化结合分子检测探针量,本章在进行乙肝样本高灵敏检测研究前对传统功能化磁性纳米颗粒的制备方法进行了改进,首先采用软模板法制备Fe304磁性纳米颗粒,并进行包被SiO2实验。包被前平均直径为500 nm,且为圆颗粒,大小比较均一,具有超顺磁性,饱和磁化强度为1.7374emu/g,制备的包被SiO2复合Fe3O4颗粒大小,平均粒径为700nm,制备后的Fe3O4@SiO2具有明显的核壳结构,具有较好的分散性,颗粒为圆形,大小均一。将磁性纳米颗粒应用于细菌和全血样本核酸提取中均获得良好的提取效果,有望开发出磁珠分离法核酸提取试剂盒。2.基于功能化磁性纳米颗粒的肝炎核酸分子提取及扩增首先针对不同来源的两种乙肝核酸提取方法提取效果进行比较分析,并对提取出来的乙肝核酸样品进行验证性实验分析。结果发现,血清肝炎病毒核酸提取量虽少,但可以应用于PCR扩增,而应用于全基因组扩增效果较差。与此同时,全血中核酸提取量较高,一方面可以用于PCR扩增,还可应用于全基因组扩增技术,这样就起到了对肝炎核酸分子富集放大的作用。经过全基因组扩增的全血乙肝核酸DNA还可以进行PCR扩增。本章还对全血乙肝核酸DNA的全基因组扩增条件进行优化分析,这为今后利用化学发光的高通量多样本测定乙肝分子检测打下了基础。3.基于纳米磁分离和化学发光的乙肝PCR扩增检测方法的建立及优化本章以生物素标记的乙肝HBV DNA为目标分子,建立了一种乙肝核酸分子的化学发光杂交检测方法,结果表明,该方法的特异性较好。通过对检测体系中涉及到的多种实验条件进行优化处理,对整个检测方法有了更深入的了解,并得出了最优化的实验条件,有望提高该方法的检测灵敏度。优化的实验条件如下:最佳颗粒含量为100 μg;SA修饰MNPs的最佳浓度为0.1 mM;氨基化探针的最佳修饰浓度为2 μM;最佳杂交温度为45℃;最佳杂交时间为30 min;该方法在低浓度范围10-10000 copies/mL内,信号强度呈线性关系,检测灵敏度达 10copies/mL。4.基于纳米磁分离和化学发光的乙肝全基因扩增检测方法的建立及优化以磁珠法全血乙肝提取DNA做模板,同时以HBV基因探针为内标,进行生物素标记的包含乙肝HBV的全血全基因组扩增,从而建立了一种乙肝核酸全基因扩增标记的化学发光杂交检测方法。通过全基因组扩增技术进行乙肝HBV的化学发光检测,有利于进一步提高该方法的检测灵敏度。结果表明,该方法的特异性较好,化学发光的杂交效率有较大的提高,优化实验条件结果如下:最佳颗粒含量为80μg;SA修饰MNPs的最佳浓度为0.1 mM;氨基化探针的最佳修饰浓度为100 μM；最佳杂交时间为40 min。5.基于环介导等温扩增(LAMP)和化学发光的病毒检测方法目前临床上用于病毒检测的方法有很多,如聚合酶链式反应(PCR)、实时荧光定量PCR(real-time qPCR)、酶联免疫吸附(ELISA)以及化学发光(CL)检测等。在这些检测技术中,基于核酸杂交的化学发光检测技术已经被广泛应用于检测乙肝、丙肝和艾滋病毒的临床检测。然而传统化学发光检测不仅需要通过聚合酶链反应(PCR)来得到有效的目标DNA,以便用于杂交,也需要长时间复杂的热循环过程和昂贵的实验仪器,这些方面的不足使得这一方法并不适合于医疗条件相对较低的社区医院或现场检测等情况。环介导等温扩增技术(LAMP)能够让核酸在等温的条件下快速且高特异性地进行核酸扩增,避免了 PCR长时间复杂的热循环过程和昂贵的实验仪器。本论文探索了一种基于逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)和化学发光相结合的办法检测RNA病毒。在LAMP扩增中加入biotin-11-dUTP使扩增产物带上生物素标记,再经过与特异性探针杂交,最后利用ALP-AMPPD化学发光反应体系判断样本中是否含有病毒核酸,以达到病原体检测目的。本论文优化了 LAMP扩增和探针杂交的相关条件,如LAMP反应温度、杂交时间、杂交温度、探针浓度等。确定了反应温度为65℃和61℃时对HBV和HCV基因的扩增效率最佳;探针浓度为10 μM,杂交时间为50 min时,对于HBV和HCV探针杂交效果最佳;然而,HBV基因最佳杂交温度为45℃,HCV探针的最佳杂交温度也为45℃。最后,通过灵敏度检测实验,我们得到本方法可以检测出103拷贝/mL的HCV-DNA和HCV-RNA。本方法相比于传统的基于PCR的化学发光检测,检测时间缩短了近1 h。此方法因基于LAMP扩增和核酸杂交,故在核酸检测方面具有高度特异性。此方法简化了检测过程,更容易实现自动化,因此在临床和现场筛查上有着广泛的应用前景。6.功能化PS微球在乙型肝炎病毒表面抗原的分子检测应用探索研究制备了一种新型的、无皂乳液聚合技术,制备了粒径合理(约400 nm)的单分散氨基官能化聚合物微球。通过扫描电子显微镜(SEM)、Zeta电位和傅立叶变换红外光谱仪(FT-IR)等各种表征方法表明,氨基基团已成功地引入到聚苯乙烯的微球表面,而且所制备的氨基化微球具有均匀的尺寸和良好的分散性等特性。随后通过将这种功能化微球固定化单克隆抗体并富集成功,从而以制备的功能化微球作为载体建立了一种基于化学发光酶联免疫分析法(ELISA)方法应用于乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的分子检测新技术。这种新的化学发光ELISA检测证明具有较好的特异性,且在使用ALP-AMPPD特定的化学发光系统中HBsAg的分子检测灵敏度较高。